胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响

胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响
张丰深1   　郑秀海2   　马宽生2   　王曙光2
【摘要】　目的 　研究胆囊收缩素对胆管癌细胞的粘附 、运动以及侵袭行为的影响 。方法 　体外 培养人胆管癌细胞系 QBC939   ,应用粘附试验 、Tra nswell 趋化运动和侵袭模型 ,研究 CC K8S 及其不同 浓度下对胆管癌细胞的粘附 、运动以及侵袭能力的影响 。结果 　CC K8S 能够以浓度依赖方式降低 QBC939 细胞的粘附 ,而促进其运动和侵袭能力 ,其受体拮抗剂 L 18 和 L 60 能够明显减弱 CC K8S 抑制 QBC939 细胞粘附的作用以及促进瘤细胞运动和侵袭的能力 ,细胞运动和侵袭实验显示 L 60 具有较强 的拮抗 CC K8S 作用的能力 。结论 　CC K8S 具有降低 QBC939 细胞的粘附 、促进 QBC939 运动和侵袭的能 力 ,CC K22 受体在影响 QBC939 细胞的运动、侵袭能力方面可能具有较强的作用 。
　　【关键词】　胆管癌 　　胆囊收缩素 　　肿瘤转移
Eff ect of cholecystokinin on cell a dhesion , migration and invasion of human bile duct carcinoma 　Z ha n g
Fe n gs he n ,  Z he n g X i u h ai ,  M a  K u ans hen g ,  W a n g S h u g u an g .   De p a rt me nt o f   Gene ral  S u r ge r y ,  324H os p i t al o f   PL A ,  Cho ngqing 400038 , China
　　【Abstract】　Objective 　To inve stigat e t he eff ect s of cholecysto kinin o n cell adhesio n , migratio n a nd inva sio n of  human  bile  duct  carcino ma  cell  line  QBC939 .   Methods 　Va r ying  co ncent ratio ns of
CC K8S  and it s recep to r antago ni st s L 18 and L 60 were used to i nve stigate t heir eff ect s o n adhe sio n , mi2gratio n a nd inva sio n of QBC939 .  Results 　CC K8S  reduced t he abilit y of adhe sio n a nd increa sed t he a bili2tie s of migratio n a nd inva sio n of QBC939  in do se2dependent manner .  L 18 and L 60 rever sed t he eff ect of CC K8S  , a nd L 60 had st ro nger eff ect  t ha n L 18 o n migratio n a nd inva sio n.  Conclusions 　CC K8S  co uld reduce t he a bilit y of adhesio n a nd increa se t he abilitie s of migratio n a nd inva sio n of QBC939  in do se2de2 p endent ma nner .  CC K22 recep to r plays mo re significant  role t ha n CC K21 in mo dulating migratio n a ndinva sio n of QBC939 .
　　【Key words】　bile duct ca rcino ma 　　cholecysto kinin 　　meta sta si s
　　胆管癌细胞易于发生早期多通道远处转移 ,而沿胆管周围神经浸润是胆管癌浸润转移的重要 特点[ 1 ]  。正常情况下 ,内脏神经末梢释放的胆囊收缩素 ( CC K) 能够通过其受体促进胆囊收缩和胃液、胰液等细胞的分泌。研究表明 , CC K 也能 够促进胃癌、胰腺癌、结肠癌等多种消化道肿瘤细胞的生长及运动[ 2 ,3 ] 。本研究以胆管癌细胞 QBC939为研究对象 ,通过观察其对胆管癌细胞的粘附、运 动以及侵袭行为的影响 ,以进一步了解胆管癌细 胞的侵袭转移机制。
1 　材料与方法
1 . 1 　材料
人胆管癌细胞系QBC939为西南医院全军肝胆外科研究所王曙光教授建株 。N I H3 T3 小鼠成纤维细胞 ,引自西 南医院全军烧伤研究所 。CC K8 S  ( Sigma , U SA ) ; L 18 及 L 60 由 Evans B E 教授 ( Merck Co , U SA ) 惠赠 ; 新生牛血 清 ( Gibco , U SA ) ; Ma rigel ( BD , U SA ) ; CC K28  试 剂 盒 (DOJ INDO ,J ap an ) ; R PM I1640  培 养 基 ( Gibco , U SA ) ; Tra nswell小室 ( 膜孔径 12 μm) ( Co star , U SA) ; 市售青霉 素 、链霉素 ; 牛血清白蛋白 (B SA ) ( Gibco , U SA ) ; 酶标仪 (B IO2RAD ,550 型 ,U SA) 。
1 . 2 　方法
1 . 2 . 1 　细胞培养 　　在 37  ℃,相对湿度 100 % , 体积分 数为 50 ml •L - 1   CO2   培养箱中 ,于含 100 ml •L - 1 新生牛血清 , 100  kU •L - 1 青霉素 , 100  mg •L - 1 链霉素的R PM I 1640培养基的条件下培养 ; 每 3 ～4  d 换液一次 ,
2 . 5 g •L - 1 胰酶每 6～7 d 消化传代一次 。
1 . 2 . 2 　趋化因子的制备 　　N I H3 T3 细胞用含体积分数 为 100 ml •L - 1 新生牛血清的 DM EM 培养液在 37  ℃、
50 ml •L - 1  CO2  条件下培养 。在细胞长势良好情况下弃 去培 养 液 , 用 无 血 清 DM EM 轻 洗 2 次 , 加 入 无 血 清DM EM 培养液继续培养 24 h ,收集培养上清液 ,过滤除菌
- 20  ℃保存备用 。
1 . 2 . 3 　粘附实验 　　参照文献 [ 4 ] 的方法并改良 , 质量浓度 (ρ) 为 2 . 5 g •L - 1 胰酶消化对数生长期 QBC939 细胞 , 无血清 R PM I 1640 培养液调整细胞密度为调至 1 ×105 个细胞/ ml ,100 μl 细胞悬液接种于已铺有 Mat rigel 的 96 孔细胞培养板中 ,分为 3 组 , CC K8S 组分别加入 1 、10 、100 nmol CC K8S  ,CC K8S  + L 18 组分别加入 1 、10 、100 nmol 相 同浓度的 CC K8S 和 L 18 , CC K8S  + L 60 组分别加入 1 、10 、
100  nmol 相 同 浓 度的 CC K8S 和 L 60 , 设空 白 对 照 。置
37  ℃、50 ml •L - 1   CO2   温育 1  h , 然后弃去培养液 , 用 PB S 洗涤 3 次 , 再加 CC K28 10 μl/ 孔 ,培养 4 h ,酶标检测 仪在 450 nm 处测定吸光值 ( A ) 。每组平行 5 个样本 。
1 . 2 . 4 　细胞运动和侵袭实验 　　参照文献 [ 5 ] 的方法 。 细胞运动实验 : 取对数生长期的 QBC939 细胞用质量浓度为 2 . 5 g •L - 1 胰酶消化 , 离心 、洗涤并重悬于无血清的DM EM 培养基中 ,每室加 100μl 1 ×105  个 QBC939 细胞悬液 ,下室加 400 μl 条件培养液 ,分为 3 组 ,CC K8S 组分别在 小室内加入 1 、10 、100  nmol  CC K8S  , CC K8S  + L 18 组分别 在小室内加入 1 、10 、100 nmol 相同浓度的 CC K8S 和 L 18 , CC K8S  + L 60 组分别在小室内加入 1 、10 、100 nmol 相同浓 度的 CC K8S 和 L 60 , 设空白对照 。每组平行 5 个样本 。
37  ℃、50 ml •L - 1   CO2  温箱内孵育 24 h 。丙酮固定 , H E染色 ,棉签擦去膜内表面未穿过膜的细胞 , 400 倍显微镜 下计数膜上下左右中 5 个不同视野的穿过膜的细胞数 , 以穿膜细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的运动能力 。侵 袭实 验 : 用 50  mg •L - 1    Mat rigel  1  ∶8 稀 释 液 包 被 Tra nswell小室底部 ,质量浓度为 10 g •L - 1  B SA 无血清 培养液水化 ,其余步骤同运动实验 。
1 . 3 　统计学处理
　　应用 SPSS10 . 0 统计 ,采用 t 检验比较样本均值差异 。
2 　结果
2 . 1 　CC K8 S 对 QB C939 细胞粘附能力的影响
　　实验结果表明 ,1 、10 、100 nmol 不同浓度 CC K8S 能够 降低 QBC939 细胞粘附能力 ,而且 CC K8S 的抑制瘤细胞粘 附的效应与其浓度呈正相关 ,L 18 和 L 60 均能够明显减 弱 CC K8S 的作用 ,但 L18 和 L 60 之间差异不明显。见表 1 。
2 . 2 　CC K8 S 对 QBC939 细胞运动和侵袭能力的影响
　　CC K8S 在 1 、10 、100 nmol 不同浓度时 ,能够明显促进QBC939 细胞的运动和侵袭能力 。而 L 18 、L 60 均能够明显减弱 CC K8 S 的作用 ,尤以 L 60 明显 ,说明 CC K22 受体在影 响 QBC939 细胞的运动和侵袭能力具有较 CC K21 重要的作用。见表 2 、3 。
3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P > 0. 05 。3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P < 0. 05 。3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P < 0. 05 。
3 　讨论
　　肿瘤转移是一个在时间和空间上高度复杂有 序的过程 。在这个过程中 ,肿瘤细胞脱离原发灶 , 通过释放和激活多种蛋白水解酶降解基底膜和细 胞外基质 ,在趋化剂、自分泌以及旁分泌生长因子 等作用下 , 经血管、淋巴管作定向迁移到达靶组 织 ,克隆增殖从而形成转移灶。CC K 在消化道及 神经系统中均具有较高含量 ,其肽能神经纤维在 中枢及消化道内分布广泛 , CC K 通过其受体即 CC K21 受 体 、CC K22/ Ga st ri n  受 体 发 挥 作 用 , CC K21 主要分布在胃肠道 、胰腺、胆道和部分脑 组织 ,而 CC K22/ Ga st ri n 在中枢神经系统及局部 胃肠道分布密度较高[ 3 ]  。
　　研究发现 CC K 受体结构为具有高度保守性 结构的 7 次跨膜受体 ,受体激活后通过其 C 末端 胞浆域与 IP32Ca2 +  通路[ 5 ] 或 G 蛋白偶联的蛋白 激酶通路[ 6 ] 偶联 ,进而发挥其影响细胞形态结构 、 促进细胞增殖、运动等作用[ 4 ]  。研究还发现多种 肿瘤细胞如胃癌、胰腺癌、结肠癌细胞等存在有 CC K 受体 , CC K 能够促进胰腺癌、结肠癌细胞的 生长 , 通过激活 CC K22/ Ga st ri n 受体能够介导人 结肠肿瘤细胞的浸润转移 , 这种作用可被 CC K 受体拮抗剂所抑制[ 7 ,8 ]   , 而且 CC K21 和 CC K22/
Ga st ri n 受体具有协同作用 ,二者同时激活能够通 过 G 蛋白信号通路传递更强的细胞生长刺激信 号[ 9 ]  。
　　既往的研究提示胆管癌细胞 QBC939 有 CC K21 和 CC K22/ Ga st ri n 受体存在 , CC K、Ga st ri n 可促 进其增殖[ 10 ,11 ]  。本研究发现 , CC K8 S 能够呈浓度 依赖方式影响 QB C939 细胞的粘附 、运动和侵袭能 力 ,生理浓度的 CC K8 S 即能够明显降低 QB C939 细 胞的粘附 ,增强其运动和侵袭能力 ,而 CC K21 及 CC K22 受体的拮抗剂 L 18 和 L 60 均能够明显减 弱 CC K8 S 抑制瘤细胞粘附的作用 ,提示 CC K21 及 CC K22 受体对于 QB C939 细胞的粘附均具有重要 作用。本研究还发现 ,外源性的 CC K8 S 与 QB C939 细胞的运动和侵袭能力呈正相关 ,L 18 、L 60 能够 明显减弱 CC K8 S 的作用 , 尤以 L 60 明显。说明 CC K22 受体在影响 QB C939 细胞的运动、侵袭能力方面可能具有较强的作用 ,其作用机制有待于进一步研究。
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