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发表时间：2014-02-07 浏览次数：301次
在我国,卒中发病率正在以每年8.7%的速度递增,目前已成为第一位的死亡原因[l]。其中,缺血性卒中是最常见的类型,约占所有卒中的60%~ 80%[2]。缺血性卒中的病理生理学机制包括酸中毒、Ca2+超载、梗死周围去极化、兴奋性氨基酸(EAA)毒性损伤、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等[3]。脑缺血后,缺血核心区的细胞由于能量障碍在数分钟内坏死[4],而在随后的再灌注过程中,氧化应激和炎症反应等机制产生的级联放大反应会启动细胞凋亡[5-6]和自噬[7],导致更大范围的细胞死亡。近年来,针对脑缺血后细胞死亡及其机制的神经保护研究已成为关注的热点。现就脑缺血后细胞死亡的形式、分子机制和干预策略做一综述,期望为缺血性卒中的治疗提供新的研究思路。
1 脑缺血后细胞死亡的形式
脑缺血后细胞死亡的形式包括坏死、凋亡和自噬(图1)[8-9]。相对于凋亡,坏死细胞在早期出现质膜完整性破坏,造成细胞外离子和液体涌人,导致细胞和细胞器肿胀[l0]。凋亡是细胞的一种主动死亡方式,包括细胞核皱缩、染色质凝集、细胞膜起泡、DNA断裂和凋亡小体形成,是受细胞内基因和细胞外因子双重调控的程序性死亡[11]。自噬是真核细胞利用溶酶体降解自身受损细胞器和大分子的一种保守过程,其特征为电镜下大量双膜腔结构的自噬体形成 [12]。自噬既可为细胞合成提供循环利用的原料,又能通过清除受损的细胞器和异常蛋白,在神经退行性疾病中发挥着积极作用;然而,过度激活自噬会引起另一种程序性死亡——自噬性死亡[13]。
2 脑缺血后细胞死亡的分子机制
2.1 坏死
脑缺血后的细胞能量障碍造成细胞膜Na+，k+-ATP酶失活,引起细胞外K+浓度升高,神经元去极化,EAA大量释放并在细胞外蓄积,同时因缺氧后酸中毒导致酸敏感性离子通道等开放,致使大量Na+、Cl-聚积在细胞内引起细胞毒性水肿,导致细胞肿胀和坏死[14]。此外,细胞外EAA会激活神经细胞膜上的N¨甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体,引起细胞内Ca+超载而激活钙依赖蛋白酶,如蛋白溶解酶、脂肪酶、磷脂酶等, 从而裂解膜蛋白和磷脂等细胞骨架结构,导致细胞溶解[15]。
在哺乳动物中,坏死细胞可释放损伤相关分子模式(DAMP),如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)[16],通过炎症反应和诱导神经元凋亡等病理生理学过程进一步加剧并扩大了脑缺血后的细胞和组织损伤[17 ]。同样,多聚(ADP核糖)聚合酶- 1[PARP-1]能通过诱导细胞坏死和凋亡加重脑缺血后组织损伤[18]。
2.1.1 HMGB1
作为一种在真核细胞内广泛表达的非组蛋白DNA结合蛋白,HMGB1能通过复杂的信号转导机制主动分泌至细胞外或由坏死细胞被动释放至细胞外[19]。在细胞外,HMGB1与细胞表面受体——晚期糖基化终产物受体(RAGE)和 Toll样受体(TLR)2/4结合,随后活化核因子-κB(NF-κB)[19]。后者可能通过激活小胶质细胞而诱发炎症反应,诱导神经元凋亡,导致级联损伤放大。此外,HMGB1还可能通过组织型纤溶酶原激活物(tPA)激活基质金属蛋白酶-9(MMP-9),进而促进对血脑屏障的破坏。
2.1.2 PARP-1
PARP-1是一种DNA修复酶,在DNA损伤时激活,并对自身和相关DNA结合蛋白进行修饰。缺血性脑损伤时,兴奋性毒性级联反应引起细胞内Ca2+超载、氧化应激和氮化应激导致大量DNA损伤。梗死区域募集免疫分子导致基因毒性应激和激活参与细胞死亡的转录因子,如核因子-κB。以上这些事件最终导致PARP-1过度活化[20]。其过度活化会耗竭细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和ATP,引起糖酵解途径阻断和线粒体功能障碍,从而导致细胞坏死 [21]。其中,PARP-1过度活化产生大量多聚(ADP核糖)[PAR],诱导凋亡诱导因子(AIF)由线粒体释放并移位至细胞核,导致细胞坏死[22,23]。此外,PARP-1过度活化致使转录因子活性发生改变,引起转录紊乱和基因异常表达,最终导致细胞死亡[20]。
2.2 凋亡
凋亡的分子机制主要涉及2条通路[4]:外源性通路和内源性通路。其中,内源性通路又称线粒体通路,主要是围绕和调节线粒体诱导细胞死亡,是脑缺血后神经元凋亡的主要通路。
2.2.1 内源性通路
脑缺血时,通过激活NMDA受体、⒍氨基-3-羟基-5-甲基 4-异嗯唑丙酸(AMPA)受体和酸敏感性离子通道等,引起细胞内Ca2+超载,导致钙依赖性蛋白酶活化并裂解促凋亡的Bcl-2家族成员Bid为有活性的截断型Bid(tBid)[24]。在线粒体外膜上,tBid诱导Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bad/Bax发生构象变化,引起线粒体转化孔开放,促使细胞色素c(CytC)和AIF漏出到细胞质内[25]。漏出的CytC与胞质内的凋亡蛋白激活因子-1 结合,并与胱天蛋白酶-9前体一起形成“凋亡小体”[26],后者激活胱天蛋白酶-9并进一步激活胱天蛋白酶-3,通过裂解 DNA修复酶(如PARP-1),从而影响DNA的修复和凋亡的诱导[26]。另一方面,AIF依赖其自身的核定位序列转位至细胞核内,以非胱天蛋白酶依赖方式介导DNA大量裂解和凋亡[27]。此外,脑缺血再灌注后产生的大量超氧阴离子(of)还可直接损伤DNA和诱导凋亡 (图2)[4]。
2.2,2 外源性通路
外源性通路,又称死亡受体通路,由细胞外肿瘤坏死因子(TNF)超家族的死亡配体引发[28]。这些配体与相关细胞表面死亡受体结合,通过募集胞质内相关蛋白形成三聚体,从而激活胱天蛋白酶蔼。以Fas为例,细胞外FasL与细胞膜上的Fas受体结合,通过募集胞质内的Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)并使其激活,进一步募集胱天蛋白酶-8前体并合形成“死亡诱导信号复合物”(DISC),从而激活胱天蛋白酶-8[29]。活化的胱天蛋白酶-8释放到胞质内,一方面通过直接激活胞质内的胱天蛋白酶名诱导凋亡,另一方面通过裂解胞质内的Bid为tBid,从而整合人线粒体通路,使死亡受体通路与线粒体通路联系起来,有效扩大凋亡信号(图3)[4]。
2.3 自噬
自噬包括微自噬、分子伴侣介导的自噬和巨自噬,通常所说的自噬为巨自噬[30]。自噬过程是指自噬前体延伸成双膜腔,包裹细胞质内成分形成球状双膜自噬体,后者与溶酶体融合形成自噬溶酶体,通过降解自噬体内包含的细胞成分产生氨基酸和脂肪酸以便重新利用[31]。因此,自噬过程主要分为4个阶段:分隔膜形成、自噬体形成、自噬体运输与融合以及自噬体降解[32]。自噬体的形成主要依赖2条泛素样蛋白加工修饰过程,即自噬相关基因12的结合和微管相关蛋白1轻链3的修饰[33]。其中,LC3以前体形式合成,在Atg4同源物水解下形成位于细胞质内的LC13-I,后者经泛素样加工修饰并与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ。一旦自噬体与溶酶体融合,自噬体内的LC3-Ⅱ即被溶酶体内的水解酶降解为LC3-I并移至细胞质,如此不断循环。由于LC3-Ⅱ定位于自噬体和自噬溶酶体膜上,而LC3-I定位于细胞质内。因此,LC3-Ⅱ含量以及LC3-Ⅱ/LC3-I比例的变化能反映自噬活性[34]。
脑缺血后自噬活性的调控涉及不同的信号通路,对自噬分别起激活或抑制的作用[35]。其中,目前对磷脂酰肌醇-3激酶-Akt-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1 通路以及AMP活化蛋白激酶-mTORC1通路的研究较为透彻。
2.3.1 PI3K-Akt-mTORC1通路
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,由mTORC1和mTORC2两个亚基构成[36]。mTORC1作为 PI3K-Akt信号通路的下游信号能抑制自噬[36]。脑缺血后,PI3K被胰岛素样生长因子等信号激活,活化的PI3K使 Akt在细胞膜上聚积,并通过磷酸化Akt使其激活[37];随后,进一步促进肿瘤抑制基因TSC2 编码的蛋白磷酸化,使之不能与TSC1形成复合物,从而激活mTORC1,抑制自噬[38]。
2.3.2 AMPK-mTORC1通路
AMPK是体内的能量平衡感受器,当各种原因导致细胞内ATP下降和AMP/ATP比值增高时,可引起AMPK激活 [39]。脑缺血后的能量障碍导致神经细胞内的AMPK激活,然后通过TSC2非依赖方式抑制mTORC1活性,从而激活 自噬[40]。
3 脑缺血后不同形式细胞死亡的神经保护
3.1 与坏死有关的神经保护
长期以来,细胞坏死都被视为一种非程序性死亡形式,无法对其进行调控。但是,已有证据表明, 在某些情况下细胞坏死能通过“程序”启动或调控[41]。众多学者利用多种动物模型作用于不同的坏死靶点来阻止脑缺血后神经元坏死。Kawamura等[42]的研究显示,缺血缺氧新生大鼠腹腔注射钙蛋白酶抑制剂MDL28170能显著抑制海马和皮质区神经元坏死。Egi等[43]的研究显示,局灶性和永久性大脑中动脉闭塞(MCAo)大鼠给予水溶性PARP抑制剂MP-124后能减轻神经元坏死。Muhammad等[44]证实,腹腔注射HMGB1多克隆抗体可阻断MCAO小鼠HMGB1 及其受体RAGE通路能减轻脑缺血损伤。
3.2 与凋亡有关的神经保护
脑缺血后,由于能量代谢障碍程度的不同,缺血区脑组织形成梗死核心区和缺血半暗带两个部分[45]。梗死核心区的细胞在脑缺血后迅速死亡,而缺血半暗带的细胞是否死亡在很大程度上取决于凋亡的强度[45]。因此,有效抑制脑缺血后细胞凋亡具有显著的神经保护作用。脑缺血预处理能显著减轻随后再次缺血引起的损害[46],而这一现象与抑制缺血区细胞凋亡有关[47]。蛋白质印迹分析证实,缺血预处理在上调Bcl-2水平的同时可下调Bax以及胱天蛋白酶-3、-6、-9水平,从而抑制大鼠海马区神经元凋亡[48]。
研究表明,脑缺血预处理抑制神经元凋亡的保护机制与机体内源性保护机制的启动有关[47],而应用外源性药物抑制脑缺血后神经细胞凋亡过程同样具有保护作用[49]。Hoehn等[50]通过使细胞内谷胱甘肽过氧化物酶过表达能减少线粒体CytC漏出,引起Bcl-2上调以及Bax和胱天蛋白酶-3下调,从而抑制神经元凋亡。Lee等[51]利用超氧化物歧化酶通过抑制AIF核转位导致的神经元凋亡,从而减轻缺血性脑损伤。由此可见,利用外源性药物对凋亡通路上的不同靶点进行干预,能减轻脑缺血后的神经元凋亡。
随着对微小RNA研究的日益增多,人们发现部分miRNA在脑缺血后神经元凋亡的病理生理学机制中发挥着重要作用[52]。作为一类高度保守的非编码小RNA分子,miRNA主要通过与靶基因结合使其降解或抑制其翻译而发挥调控作用[52]。目前的研究证实,miR-21可抑制神经元凋亡[53],而miR-497可促进神经元凋亡[54]。
3.3 与自噬有关的神经保护
自噬对脑缺血后神经元具有保护作用还是损害作用目前还存在着争议。Carloni等[55]的研究显示, 新生大鼠缺血缺氧早期给予自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)后,皮质和海马区神经元坏死加重;而应用自噬激动剂雷帕霉素后相应脑区神经元坏死显著减轻。Yan等[56]对MCAO模型大鼠进行的研究显示,高压氧预处理能提高自噬活性从而减轻缺血性脑损伤。Wen等[57]的研究表明,成年大鼠永久性MCAO后LC-3和组织蛋白酶明显增加,应用3-MA和组织蛋 白酶抑制剂能显著缩小梗死体积,提示抑制自噬活性具有保护作用。而Shi等[58]利用透射电镜观察氧-葡萄糖剥夺原代培养大鼠皮质神经元发现,过度激活自噬会导致神经元死亡。上述研究表明,自噬对脑缺血神经元的作用可能与动物模型的选择、神经元损伤程度以及自噬的激活程度有关,对于缺血后的神经元而言,自噬如同一把“双刃剑”,适度激活自噬对脑缺血具有保护作用,过度激活自噬则具有损害作用[59]。
4 结语
综上所述 ,脑缺血后细胞死亡的病理生理学机制错综复杂,相互影响,针对其机制和过程的多种外源性和内源性干预能减轻缺血性脑损伤。在某些情况下,凋亡和坏死具有共同的诱发因素,有时自噬激活的同时会抑制坏死[60],而有时凋亡与自噬可共存于同一细胞。因此,脑缺血后细胞凋亡、自噬和坏死三者之间相互促进和相互拮抗。而脑缺血后细胞死亡的分子机制及其干预策略,仍将是今后研究的重点。
参考文献
[1] Getz GS,Reardon CA, Animal models of atherosclerosis .Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32:1104-1115.
[2] Lloyd Jones DM,Nam BH,D'Agostino RB Sr et al.Parental cardiovascular disease as a risk factor for cardiovascular disease in middle-aged adults: a prospective study of parents and offspring.[J].The Journal of the American Medical Association,2004,291(18):2204-2211.
[3] Pozo M,Castilla V,Gutierrez C, et al.Ursolid acid inhibits neointinma formation in the rat carotid injury model.Atherosclerosis,2006,184:53-62.
[4] Ross R Athclosdclosis— an inflammatory disease. N Engl J Med,1999,340:115-126.
[5] Booth RF;Martin JF;Honey AC.Rapid development of atherosclerotic lesions in the rabbit carotid artery induced by perivascular manipulation[J].Atheroclerosis,1989,76:257-268.