坐骨神经逆行示踪放射自显影显像的初步实验研究

作者：石光清，刘昌雄，张朝跃，邱娟，向谷良，易西南，郑林丰，戴中伟    作者单位：（中南大学湘雅三医院核医学科，湖南 长沙 410013；中南大学湘雅三医院骨科，湖南 长沙 410013；海南医学院人体解剖学教研室，海南 海口 571101）
【摘要】  目的 研究131碘辣根过氧化物酶(131IHRP)通过逆行示踪及放射自显影显像坐骨神经的可行性，为临床应用放射性同位素神经示踪成像提供实验依据。方法 采用新西兰兔随机分为131IHRP组、Na131I组、生理盐水组。在左侧小腿三头肌分别注入131IHRP、Na131I或生理盐水500μl，于注射后6、12、24、48、72小时后处死动物，取左侧带小腿三头肌的坐骨神经全长行放射自显影和坐骨神经HRP组织化学染色。结果131IHRP组注射后6小时局部肌肉组织显影；随着时间的延长，坐骨神经逐渐显影；注射后72小时，坐骨神经全长均有显影，背根神经节有显影。各时相点间坐骨神经自显影长度差异有统计学意义(P﹤0.01)。HRP组织化学染色显示注射后6小时坐骨神经远段有少量阳性纤维；12小时近段逐渐出现大量的HRP反应阳性纤维；注射后72小时，背根节内出现HRP阳性细胞和纤维。Na131I组和生理盐水组注射后未见坐骨神经显影和HRP阳性和纤维。结论 131IHRP可以在坐骨神经内逆行运输，采用放射自显影技术可以显示坐骨神经。
【关键词】  放射自显影；131碘；辣根过氧化物酶；坐骨神经
　　Preliminary study of image in sciatic nerve by retrotracing and autoradiography
　　SHI Guangqing,LIU Changxiong,ZHANG Chaoyue,et al.
　　(Department of Nuclear Medicine,Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha  410013,China）
  　Abstract：  Objective  To study the feasibility of image in sciatic nerve by autoradiography through131Iodine horseradish peroxidase(131I-HRP) retrotracing and to provide the experimental evidence in neuroimaging by radioisotope.Methods  NewZealand rabbits were randomly divided into 131IHRP group,Na131I group and saline group.Then 500 μl 131IHRP,Na131I or saline was injected intramuscularly in left triceps surae respectively and then sacrificed at 6,12,24,48 and 72 hours after the injection.The image of sciatic nerve was detected by autoradiography and histochemistry.Results  After 131IHRP injection,the image by autoradiography emerged in muscular tissue around injection site at 6 hours and gradually enhanced in distal segment of sciatic nerve with increasing time.The total length of sciatic nerve and dorsal root ganglion developed an image at 72 hours after injection.There was significant difference between each time pointas compared with the length of image(P<0.01).No positive image emerged in muscular tissue and sciatic nerve at 72 hour in Na131I group and saline group by radiography except obscure image in local triceps surae after 6 hours in Na131I group.HRP histochemical staining found that there was a sprinkle fibers in distal segment of sciatic nerve in 131IHRP group at 6 hours.Moreover,massive positiveHRP fibers were found at 12 hours,which could be found at full length of sciatic nerve at 72 hours.Also,HRP positiveneurons in dorsal root ganglion were found at 72 hours.However,no HRP positive fibers were found in Na131I and saline group.Conclusion  131IHRP can be retrograde transported in sciatic nerve,which can be traced with  autoradiography.

Key words：autoradiography；131iodine；horseradish paroxidase；sciatic nerve
   
　　闭合性周围神经损伤目前尚无理想的定位诊断方法，如果需要手术修复，术者只能凭借临床表现、肌电图等方法判断损伤部位，一旦出现判断失误，常导致切口延长甚至错失手术修复的黄金时机。因此，寻找一种神经损伤早期无创性定位诊断方法具有重要的临床意义［1］。以放射性核素或其标记的化合物作为示踪剂，应用射线探测方法能检测其行踪，可研究示踪物在机体的动态变化规律。已有学者利用放射性核素示踪技术检测神经损伤后再生神经的轴浆流［2，3］；有的学者通过放射自显影技术来研究周围神经损伤后药物治疗的效果［4］。但是，采用放射自显影显示周围神经尚缺乏可靠的实验数据，为此本研究采用131碘辣根过氧化物酶(131IHRP)放射自显影的方法来显示坐骨神经，为临床应用放射性同位素神经成像提供实验依据。

　　材料与方法

　　1  动物及分组
   
　　健康成年新西兰兔27只(中南大学实验动物学部提供)，雌雄各半，体重（2000±100）g。采用随机数字表随机分为3组：131IHRP组（n＝15）、Na131I组（n＝6）、生理盐水组（n＝6）。131IHRP组分为6、12、24、48、72小时5个时间点，每时间点3只动物。Na131I组和生理盐水组分为6、72小时2个时间点，每时间点3只动物。

　　2  动物实验
   
　　HRP（sigma）采用Iodogen法预先标记131I（标记率为70%～80%，放化纯度﹥95%，放射性浓度为608.03KBq/ml，放射性比活度为1221KBq/μg）。动物俯卧位固定于家兔手术架上，后肢剃毛，常规消毒后用微量注射器将500μl131IHRP（实验组）或Na131I或生理盐水分3点呈“Z”字形缓慢注入左侧小腿三头肌。注射后留针1分钟，按压针道防止药物流出。分别于注射后6、12、24、48、72小时麻醉处死动物。在L3～4处椎板开窗，显露L4～S1神经根，顺坐骨神经走向完整取出脊髓、双侧坐骨神经带双侧小腿三头肌。为便于判断坐骨神经逆行示踪长度和部位，先取出1只未经处理的动物右侧坐骨神经及脊髓，按胫神经入肌腹处为A点，出脊髓处为B点，AB连线的中点为C点，AC间等分为3段，分别记为1、2、3段；CB间等分为3段，分别记为4、5、6段(近肌肉端为1段，近脊髓端为6段，神经节位于第6段，中间的依此类推)（图1a）。

　　3  放射自显影
   
　　将取下左侧带脊髓及小腿三头肌的坐骨神经铺平放入透明塑料薄膜袋中，暗室中将塑料薄膜袋紧贴于X线感光胶片，两侧用X线增感屏夹好，胶布固定，再置于避光锡箔纸中密封，外套X线片盒，盒内置干燥剂，封口。置4℃持续曝光48小时后，在暗室中取出X线片进行常规显影、定影处理。标本显影完成后，按顺序分割成段，置入固定液2小时后行常规HRP组织化学染色。

　　4  HRP组织化学染色
   
　　将坐骨神经及脊神经节置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液后固定2小时（4 ℃）后浸入20%、30％蔗糖中（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH 7.4）4 ℃至标本沉底。OCT胶包埋，连续恒冷冰冻切片，片厚约10μm。将神经切片置于新鲜配制的含0.03％H2O2的0.05％DAB显色液室温避光显色，显微镜下观察，0.01mol/L PBS终止反应。裱片，自然干燥，常规脱水透明，中性树胶封片。

　　5  统计学分析
   
　　在胶片上用游标卡尺测量由胫神经穿肌腹处至近端神经显影的长度，数据用±s表示，采用方差分析（A oneway ANOVA），各时间点分别与前一时间点比较，用成组“t”检验，分析用SPSS13.0软件进行。各段神经的切片采用motic数码图像采集系统拍照。

　　结果

　　1  坐骨神经放射自显影结果
   
　　坐骨神经主干显影随时间增加自远段向近段显影长度增加(图1)。131IHRP组注射后6小时，只有局部肌肉组织显影，在胫神经肌支入肌处似有部分显影，坐骨神经主干未见显影(图1b)；注射后24小时，注射部位肌肉显影变淡，坐骨神经1段有显影，2段有部分显影（图1c）；注射后48小时，坐骨神经1、2、3段有显影(图1d)，4段有部分显影；注射后72小时，肌肉显影更淡，坐骨神经全长均显影，背根神经节段有显影(图1e)。各时相点间坐骨神经自显影长度与前一时间点比较，差异有统计学差异(P﹤0.01)（表1）。

　表1  各时相点间坐骨神经自显影长度（略）

　　与前一时间点比较：*P﹤0.01
   
　　Na131I组在注射后6小时，小腿三头肌局部有显影，在坐骨神经各段均未见显影；在72小时，小腿三头肌和坐骨神各段经均无显影。生理盐水组在注射后6小时和72小时，小腿三头肌和坐骨神各段经均无显影。

　　2  坐骨神经HRP组织化学结果
   
　　131IHRP注射后6小时坐骨神经远段有少量阳性反应纤维；注射后12小时近段逐渐出现大量的HRP反应阳性纤维；24、48小时分别在坐骨神经第2段、第4段出现HRP反应阳性纤维(图2a、b)；注射后72小时，背根节内出现HRP阳性细胞和纤维(图2c)。Na131I组和生理盐水组注射后未见坐骨神经显影和HRP阳性和纤维。

　　a.坐骨神经分段；b.注射后6h;c.注射后24h;d.注射后48h;e.注射后72h

　　图1  131IHRP组坐骨神经放射自显影显像结果（箭头指背根神经节）（略）

　　a.注射后24h坐骨神经第2段;b.注射后48h坐骨神经第4段;c.注射后72h背根神经背根神经节

　　图2  131IHRP组HRP组织化学结果（×100）（略）

　　讨论
   
　　辣根过氧化物酶(HRP)能由神经纤维逆行和顺行运输，如肌肉注射后，能被神经末梢通过胞饮的方式摄取，经神经轴浆逆流转运至神经元胞体［5］。有研究采用125I标记HRP来研究神经轴浆流［6］。125I和131I虽然两者的物理、化学特性相同，但前者γ射线能量较低，穿透能力弱；后者γ射线能量较高，穿透能力强，更适合显像，因此我们选用131I标记HRP。
   
　　实验结果显示131IHRP组在注射后6小时肌肉显影最明显，随着时间的增加肌肉显影减淡且HRP扩散带缩小，这符合131I衰变规律。注射后6小时，注射局部肌肉显影而神经未显影，但是在HRP组织化学染色发现少量HRP染色的阳性纤维，推测可能与131IHRP在局部肌肉组织扩散及被神经末梢吸收需要一段时间，由神经末梢胞饮吸收至胫神经入肌支处也存在着一定的距离，由于时间尚短，故只有局部肌肉组织显影；另外核素量太少，不能让X胶片感光亦可能是一个原因。在以后的时间点，坐骨神经显影结果与HRP结果一致，Na131I组和生理盐水组均未出现阳性结果，表明131IHRP可以被神经末梢通过胞饮作用吸收，随神经轴浆流逆行转运，通过采用用放射自显影可以显示坐骨神经。根据鞠躬［7］提出的HRP最佳存活期相当于按纤维长度所需的输送时间加1天。我们初步判断在实验中131IHRP在兔坐骨神经内轴逆行浆流转运速度为41.4mm/d左右。这与Kristensson等［8］测定的HRP逆行运输速度相近。
   
　　综合上述试验结果，我们认为采用131IHRP注射后放射显影技术可较好的显示坐骨神经，这种方法有较好的灵敏性与特异性。此种方法的影像学规律以及在神经损伤后的应用研究将有重要的临床价值。

【参考文献】
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　　［2］尹宗生,顾玉东,朱建华，等.125碘辣根过氧化物酶评价手术后神经再生的实验［J］.中华显微外科杂志，2002，25(4)：285-287.

　　［3］徐文东，邓守真，徐建光，等.鼠坐骨神经再生早期轴浆流改变的实验研究［J］.中华手外科杂志，1998，14(4):239-241.

　　［4］Nath RK，Kwon B，Mackinnon SE，et al.Antibody to transforming growth factor beta reduces collagen production in injured peripheral nerve［J］.Plast Reconstr Surg，1998，102(4):1100-1106.

　　［5］张文捷，周跃，陈菁，等.GDNF基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用［J］.第三军医大学学报，2004，26(20):1826-1829.

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［7］鞠躬.神经解剖学方法［M］.北京：人民卫生出版社,1985.97.

　　［8］Kristensson K,Olsson Y.Retrograde transport of horseradish peroxidase in transected axons. II. relations between rate of transfer from the site of injury to the perikaryon and onset of chromatolysis［J］.J Neurocytol，1975,4(6):653-661.