Wnt信号通路调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

间充质干细胞(mesenchymalstemce11s,MSCs)是近年来发现的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，主要存在于骨髓，体外分离培养后在不同的诱导条件下MSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞等多种细胞系分化的能力：l。研究[2]表明，多重信号通路调控MSCs向成骨细胞分化，以往认为MSCs的定向分化主要与转化生长因子β(transfoklllinggowthhctor-β，TGF-β)/骨形态发生蛋白(bonemorpho胆n9hcproteins,BMPs)、丝裂原活化蛋白激酶(mltclun~"tlv甜edproteinkinase,MAPK)通路有关[3];近年来研究[4’5]发现，经典和非经典Wllt通路在MSCs成骨分化中同样发挥至关重要的作用，对其作用机制的研究为骨代谢性疾病的治疗提供了新的途径[6].

1概述

Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的糖脂蛋白，由23~z个半胱氨酸构成其保守区。目前在哺乳动物中已发现至少19种Wnt基因，分别命名为Wnt1、Wnt2、Wnt3和Wnt3a等，Wnt蛋白与膜受体结合后可激活Wnt信号通路，产生不同的生物学效应[7]。Wnt信号通路以是否有β连环蛋白(β-catenin)参与而分为经典Wnt信号通路和非经典信号通路。

经典信号通路以β-catenin稳定表达及向核内转移为特征。在缺少Wnt配体时，β-catenin与大肠腺瘤样蛋白(adenomat。uspolyposisco1i,APC)、核心蛋白(Axin)结合，经酪蛋白激酶Iα(caseinkinase1α，CK1α)、糖原合成激酶3β(glycogenqyntha⒃kase-3β，GSK3β)的磷酸化[:],被转导重复相容蛋白(transducinrepeatcontaininguotein,TrCP)介导的泛素/蛋白酶体途径降解[9]。当某种Wnt配体表达时与共受体Fzd、低密度脂蛋白受体相关蛋白(llpopr。~∞inreceptor-re1atedprotein,LRP5/6)相互作用，调动GSK3β、CKI至细胞膜，募集DⅤL、A蛀n1”、小凹蛋白至胞质侧，形成LRP5炻疝n-FRAT复合体，从而引走：AxinFy+k解[IO_12],β~cateninl,KAPC-Axin-GSK3β复合体解离出来，使胞内β-ac山水平升高，从核内转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(Tce11hctor,TCF/1ymphoidelhancerfador1,LEF1)中罩换出共抑制因子组蛋白去乙酰化酶(histonedeacety1ases,HDACs)，从而调节基因表达。

非经典信号通路根据其所激活的数个不同级联反应分为Wnt/PCP、Wnt/c-JLln氨基端激酶(c¨JunN-柁rm血alhmse,JNK)、Wnt/Ca2+和Wnt/Rho通路[:],这些通路由Fzd及其共受体如Ror、Ryk的活化而激活[14],通过Dvl依赖或钙依赖机制进行信号转导[15]。wnt配体与Fzd及共受体Ror2结合后再与Dsh相互作用，募集信号因子Ⅴang、Phckle等于胞膜处，通过下游的转导信号Jtln、Dmm和RhoA等发挥其生物学效应[16]cRh。GTP酶超家族成员Rac1可使Dvl活化从而激活JNK,进而激活转录囚子c-Jun和ATF2[17’1:。wⅢ与Fzd的结合也可促进Dxrl与蛋白Daam1的相互作用，激活Rho的鸟嘌呤核核苷酸交换因子(gua血llenuc1eohdeext·langefactor,GEF)∶⒚],从而诱导Rho/Rock通路，通过细胞骨架重建调控细胞形状和黏附功能20∶。非经典Wnt蛋白还可通过激活G蛋白耦联受体调控下游信号通路，有文献[21∶报道了生理状态下Fzd与G蛋白的相互作用。在脑组织中Wl·t/Fzd通过Gαs蛋白诱导cAMP积聚激活PKA[22],而G蛋白信号特别是Gαq11也是β-catenin核定位需要的：231。

2经典Wnt信号通路对MsCs成骨分化的调节

经典Wnt通路由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8及Wnt8b等经典Wllt配体激活。大量实验研究表明经典Wl·t通路在促进成骨细胞发生中具有重要作用，经典通路各成分的改变均可影响成骨分化cQ血等[24|发现人LRP5激活型突变导致高骨量表型，骨组织活检示骨小梁增多，骨髓内脂肪减少，而LRP5失活性突变导致骨质疏松。在体外用Wnt3a处理转导活化LRP5的人MSCs,细胞内碱性磷酸酶(a1kahneplosphdtase,ALP)表达增多，脂滴形成减少，移植于小鼠皮下的支架有矿化骨形成，转导失活LRP5可看到相反的结果。实验证明LRP5能够通过上调Cbfa1/Runx2和ALP的表达，即通过经典Wnt通路促进人骨髓间充质干细胞(bone  mesenchymal  stem  cells, bmscs)的成骨分化，同B,l通过下调CEBPα和PPARγ的表达抑制脂肪形成[24[。GsK3β是经典Wllt通路的重要成分，可使β-catenh、A虹n和APC磷酸化，从而促进β-catenin的降解，GSK3β杂合小鼠Runx2转录活性增强，骨量增多[25|,Gs(β抑制剂hcl处理后小鼠亦表现为骨量增多[26[。β~c敲e血n是经典Wl·t通路的关键信号蛋白，将向成骨细胞系分化的MSCs选择性敲除这一基因，导致异位软骨细胞发生，正常成骨受抑制[27]。目前，对于Wnt拮抗因子的研究更进一步证实了经典Wl·t通路对成骨分化的调节作川c研究]2:J表明，分泌型FRZB作为Wnt蛋白的拮抗因子，过量表达时可终止人类软骨膜细胞在小鼠的异位成骨cYacl等[29]发现，过表达Wnt蛋白拮抗因子DKK1的转基因大鼠成骨细胞数量明显减少，血^清骨钙素水平显著降低。Fu1ci11ii等[Ⅱ]证实在一些多发性骨肉瘤疾病模型中，DKK1抗体显著增加，成骨细胞数量明显减少，骨小梁体积明显减小，血清骨钙素水平显著降低。

上述研究表明，经典Wnt通路对促进MSCs成骨分化起到关键性调节作用c然而，有些实验结果并不完全一致。有文献：31刂艮道，体外培养的人MSCs加人Wnt3a后ALP的表达及活性降低，未分化的成骨祖细胞自我更新及扩增能力增强，表现为成骨抑制。Quart°等：32]分别用Wnt3a处理未分化的间充质细胞mAscs、E16、幼龄小鼠颅骨成骨细胞FllN1以及完全分化的成年小鼠颅骨成骨细胞F1oN60,Wlt3a显著抑制mAscs、E16及FlDN1细胞成骨，并随着Wlilt3a浓度的升高抑制作用显著增强。相反，FPN60成骨分化能力随着Wnt3a浓度的升高而增强。低剂量Wnt3a可促进幼鼠颅骨愈合及重建，高剂量外源性Wnt3a或LRP5超表达导致Wllt信号超活化，损害未成熟颅骨的重建，但成年小鼠恰恰相反。这些结果说明，经典信号对成骨分化的作用可能取决于靶细胞的分化阶段及Wllt配体的浓度。Quarto等[32]还发现，MSCs具有更高的内源性经典Wllt信号水平，与Wllt拮抗因子水平低有关，成骨分化过程中拮抗因子逐渐上调，提示内源性Wnt信号高水平是MSCs保持未分化状态所需的，Wllt信号是否通过拮抗因子在MSCs增殖与分化之间建立平衡及其作用机制仍有待研究。再者，由于研究所使用的MSCs来源不同，细胞背景差异以及体外培养条件不同均会影响Wllt通路的调节作用。

此外，由于Wnt信号对成骨分化的调控在分子水平上的机制尚未完全清楚，目前认为β-catenh基因敲除影响Wnt对成骨分化的调控能力，Wnt通过β-caten血激活MSCs成骨分化，β-catenin可能是通过对Wnt靶基因ALP的转录或通过抑制PPARγ的转录调控成骨分化[33]。也有文献[34.35]报道，经典Wnt信号通过上调RLlnx2、D1x5和O吱e五x表达促进成骨。

3非经典Wnt信号通路对MsCs成骨分化的调节

目前关于非经典Wnt通路对成骨分化调节的研究报道相对较少，非经典Wnt通路由非经典配体Wnt5a及WntzI等启动，并激活各种信号通路c有研究[36]表明，Wn6a杂合的男性表现为骨量减少、骨密度降低以及骨小梁数目减少。Wllt5a可能在干细胞成骨分化的早期阶段发挥作用，与RhoA酪氨酸激酶受体结合后激活洲Κ通路，诱导RunⅩ2和骨保护素的表达，但骨钙素的水平不受影响[37]。wnt4可通过激活p38-MAPK通路促进人颅面组织MSCs体外成骨分化，增强体内Wnt4信号可促进颅面骨缺损的修复[3:1。已有研究[14]表明，非经典Wnt信号成分Ro⒓突变与某些骨骼疾病有关，如显性B剐短指症，说明其在软骨内成骨中起作用。受体蛋白Ror2的过表达导致Runx2和Ostehx上调，而Ror2的反义RNA可抑制MSCs成骨分化：39|。有实验[40[证明，非经典Wnt/JNK通路与促进人和大鼠MSCs向成骨细胞分化及抑制其向脂肪细胞分化有关。

4经典与非经典Wnt信号通路的相互作用对MSCs成骨分化的调节

Wnt蛋白最初被分为经典和非经典两类，而Wnt1、Wnt3a和Wntz+根据Fzd受体/共受体及分泌的抑制因子表达情况、胞质Wnt信号调控因子的活性等对两种通路均有激活作用。Qltl等[5]发现，以Wnt3a分别处理携带LRP5两种突变基因的hMSCs,两组经典Wnt拮抗因子，如Axin2、Dkk1、Fzd1和NKD1等的表达均上调，其中NKD1表达上调最显著;处理第3天，Wlltl1和Wllt5a的表达显著上调，蛋白免疫印迹证明非经典的Wnt/JNK通路活化;提示Wnt3a可能在激活经典通路，促进MSCs土曾殖后通过负反馈调节机制激活非经典JNK通路，促进成骨分化。ψu等[41]发现Gsα基因剔除的小鼠骨量严重减少并伴随正常骨生成障碍，骨组织以骨量及强度不足的编织骨为主，成骨细胞数量显著减少，而Wnt抑制因子硬化蛋白scler°sun和dkkkopf1(Dkk1)表达增强，说明Gsα与Wnt通路存在联系。Gsα可能通过多条通路影响Wn'β~tate血n信号，Gsα是否通过非经典信号影响经典Wnt/β-caten血信号仍有待研究。总之，经典Wnt信号与非经典信号之间存在着相互作用，共同决定了MSCs的分化方向，两者在成骨分化调节中的相互作用机制还需进一步探索。

5 WIlt信号通路在骨代谢疾病治疗方面的应用

骨质疏松症是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，该疾病是由于成骨细胞形成骨和破骨细胞对骨的重吸收不平衡所导致。目前，骨质疏松症的治疗方案主要是抑制及预防骨的重吸收或小剂量甲状旁腺激素促进骨形成。越来越多的证据表明，Wnt信号通路在MSCs成骨分化和骨形成过程中发挥着关键性调节作用，人为地抑制Wnt拮抗因子已经在骨质疏松症等骨代谢疾病的治疗上凸显出其应用潜能。例如，sc1eroshn是由成熟成骨细胞分泌的Wnt拮抗因子，其启动子的改变与骨质疏松症有关[42];目前以其作为靶蛋白的动物实验已取得了满意的效果，给予雌激素缺乏大鼠抗scleros“n抗体可使其骨形成增强。在临床试验第一阶段，绝经后妇女皮下注射抗scleroshn抗体可增加其腰椎的骨密度[43]。目前，各种新型GSK-3抑制剂的药物实验也引起人们的广泛关注。AZD2858作为一种新型强效GSK¨3抑制剂处理人成骨细胞12h后即可增强细胞内β-catenin表达水平;以AZD2858灌胃处理大鼠，2周后可见骨小梁和皮质骨的骨量增加，且~呈剂量依赖性;生物力学实验证实大鼠脊柱抗压强度也明显增强，血清中骨形成及骨吸收标志物均增加[44]。另一种GSK-3抑制剂AR28可促进具有成骨及成脂潜能的MSCs亚群早期短暂增殖波动从而驱动其成骨分化，AR28皮下注射14d后小鼠骨量明显增加[45[。虽然Wllt信号通路在骨代谢疾病治疗方面有应用前景，但以Wl·t通路为靶点的治疗并非没有风险，Wnt/β-catenin的过度激活可能与多种肿瘤有关，从而使个体倾向于致瘤表型，这些问题仍有待解决，新型制剂的临床试验工作也需要进一步完善。

6结语

综上所述，通过对Wllt信号通路成分的基因敲除，复制疾病模型及分子水平基因测定已经明确了其对MsCs成骨分化的重要调控作用，研究Wnt信号调控机制为骨代谢性疾病如骨质疏松症的治疗提供了新思路，也为骨组织工程、基因治疗等的发展提供了新途径。然而，目前Wnt信号调节成骨分化过程的分子水平机制仍未完全阐明，如尽管已确定β-catenin是调节的关键，但其下游靶基因的转录仍无定论，故最终效应机制仍有争议。而Wnt信号在细胞微环境的影响下与多种信号通路存在交互作用，共同调节成骨分化，这其中的机制错综复杂，也需要进一步探讨加以阐明。随着研究的深人，新的Wllt通路成员也有待被发现。

参考文献

[1]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,（5411）：143-147.doi:10.1126/science.284.5411.143.
[2]Hong JH,Hwang ES,McManus MT. TAZ,a transcriptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation[J].Science,2005,（5737）：1074-1078.
[3]Jadlowiec J,Koch H,Zhang X. Phosphophoryn regulates the gene expression and differentiation of NIH3T3,MC3T3-E1,and human mesenchymal stem cells via the integrin/MAPK signaling pathway[J].Journal of Biological Chemistry,2004,（51）：53323-53330.
[4]Boland GM,Perkins G,Hall DJ. Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymalstem cells[J].Journal of Cellular Biochemistry,2004,（06）：1210-1230.doi:10.1002/jcb.20284.
[5]Qiu W,Chen L,Kassem M. Activation of non-canonical Wnt/JNK pathway by Wnt3a is associated with differentiation fate determination of human bone marrow stromal （mesenchymal） stem cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,（01）：98-104.
[6]Wagner ER,Zhu G,Zhang BQ. The therapeutic potential of the Wnt signaling pathway in bone disorders[J].Curr Mol Pharmacol,2011,（01）：14-25.
[7]Rao TP,Kuhl M. An updated overview on Wnt signaling pathways:a prelude for more[J].Circulation Research,2010,（12）：1798-1806.
[8]Glass DA,Karsenty G. In vivo analysis of Wnt signaling in bone[J].Endocrinology,2007,（06）：2630-2634.doi:10.1210/en.2006-1372.
[9]Westendorf JJ,Kahler RA,Schroeder TM. Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases[J].Gene,2004.19-39.
[10]Bilic J,Huang YL,Davidson G. Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation[J].Science,2007,（5831）：1619-1622.doi:10.1126/science.1137065.
[11]MacDonald BT,Tamai K,He X. Wnt/beta-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J].Developmental Cell,2009,（01）：9-26.
[12]Niehrs C,Shen J. Regulation of Lrp6 phosphorylation[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2010,（15）：2551-2562.
[13]Liu F,Kohlmeier S,Wang CY. Wnt signaling and skeletal development[J].Cellular Signalling,2008,（06）：999-1009.doi:10.1016/j.cellsig.2007.11.011.
[14]Angers S,Moon RT. Proximal events in Wnt signal transduction[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2009,（07）：468-477.
[15]Lu W,Yamamoto V,Ortega B. Mammalian Ryk is a Wnt coreceptor required for stimulation of neurite outgrowth[J].Cell,2004,（01）：97-108.
[16]Katoh M. WNT/PCP signaling pathway and human cancer （review）[J].Oncology Reports,2005,（06）：1583-1588.
[17]Ohkawara B,Niehrs C. An ATF2-based luciferase reporter to monitor non-canonical Wnt signaling in Xenopus embryos[J].Developmental Dynamics,2011,（01）：188-194.
[18]Sato A,Yamamoto H,Sakane H. Wnt5a regulates distinct signalling pathways by binding to Frizzled2[J].EMBO Journal,2010,（01）：41-54.
[19]Gao C,Chen YG. Dishevelled:The hub of Wnt signaling[J].Cellular Signalling,2010,（05）：717-727.
[20]Koval A,Katanaev VL. Wnt3a stimulation elicits G-protein-coupled receptor properties of mammalian Frizzled proteins[J].Biochemical Journal,2011,（03）：435-440.
[21]Witze ES,Litman ES,Argast GM. Wnt5a control of cell polarity and directional movement by polarized redistribution of adhesion receptors[J].Science,2008,（5874）：365-369.
[22]Tu X,Joeng KS,Nakayama KI. Noncanonical Wnt signaling through G protein-linked PKCdelta activation promotes bone formation[J].Developmental Cell,2007,（01）：113-127.doi:10.1016/j.devcel.2006.11.003.
[23]Qiu W,Andersen TE,Bollerslev J. Patients with high bone mass phenotype exhibit enhanced osteoblast differentiation and inhibition of adipogenesis of human mesenchymal stem cells[J].Journal of Bone and Mineral Research,2007,（11）：1720-1731.doi:10.1359/jbmr.070721.
[24]Kugimiya F,Kawaguchi H,Ohba S. GSK-3beta controls osteogenesis through regulating Runx2 activity[J].PLoS One,2007,（09）：e837.
[25]Clement-Lacroix P,Ai M,Morvan F. Lrp5-independent activation of Wnt signaling by lithium chloride increases bone formation and bone mass in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences（USA），2005,（48）：17406-17411.doi:10.1073/pnas.0505259102.
[26]Day TF,Guo X,Garrett-Beal L. Wnt/beta-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis[J].Developmental Cell,2005,（05）：739-750.
[27]Eyckmans J,Roberts SJ,Schrooten J. A clinically relevant model of osteoinduction:a process requiring calcium phosphate and BMP/Wnt signaling[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine,2010,（6B）：1845-1856.
[28]Yao GQ,Wu JJ,Troiano N. Targeted overexpression of Dkk1 in osteoblasts reduces bone mass but does not impair the anabolic response to intermittent PTH treatment in mice[J].Journal of Bone and Mineral Metabolism,2011,（02）：141-148.
[29]Fulciniti M,Tassone P,Hideshima T. Anti-DKK1 mAb（BHQ880）as a potential therapeutic agent for multiple myeloma[J].Blood,2009,（02）：371-379.doi:10.1182/blood-2008-11-191577.
[30]de Boer J,Siddappa R,Gaspar C. Wnt signaling inhibits osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Bone,2004,（05）：818-826.
[31]Quarto N,Behr B,Longaker MT. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells:implications for tissue engineering[J].Tissue Eng Part A,2010,（10）：3185-3197.
[32]Cawthorn WP,Bree AJ,Yao Y. Wnt6,Wnt10a and Wnt10b inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through a beta-catenin-dependent mechanism[J].Bone,2012,（02）：477-489.
[33]Stevens JR,Miranda-Carboni GA,Singer MA. Wnt10b deficiency results in age-dependent loss of bone mass and progressive reduction of mesenchymal progenitor cells[J].Journal of Bone and Mineral Research,2010,（10）：2138-2147.
[34]Bennett CN,Longo KA,Wright WS. Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b[J].Proceedings of the National Academy of Sciences（USA），2005,（09）：3324-3329.doi:10.1073/pnas.0408742102.
[35]Takada I,Mihara M,Suzawa M. A histone lysine methyltransferase activated by non-canonical Wnt signalling suppresses PPAR-gamma transactivation[J].Nature Cell Biology,2007,（11）：1273-1285.doi:10.1038/ncb1647.
[36]Arnsdorf EJ,Tummala P,Jacobs CR. Non-canonical Wnt signaling and N-cadherin related beta-catenin signaling play a role in mechanically induced osteogenic cell fate[J].PLoS One,2009,（04）：e5388.
[37]Chang J,Sonoyama W,Wang Z. Noncanonical Wnt-4 signaling enhances bone regeneration of mesenchymal stem cells in craniofacial defects through activation of p38 MAPK[J].Journal of Biological Chemistry,2007,（42）：30938-30948.
[38]Arnsdorf E J,Tummala P,Kwon RY. Mechanically induced osteogenic differentiation-the role of RhoA,ROCKII and cytoskeletal dynamics[J].Journal of Cell Science,2009,（Pt 4）：546-553.doi:10.1242/jcs.036293.
[39]Fu L,Tang T,Miao Y. Stimulation of osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation in bone marrow stromal cells by alendronate via ERK and JNK activation[J].Bone,2008,（01）：40-47.doi:10.1016/j.bone.2008.03.008.
[40]Wu JY,Aarnisalo P,Bastepe M. Gsalpha enhances commitment of mesenchymal progenitors to the osteoblast lineage but restrains osteoblast differentiation in mice[J].Journal of Clinical Investigation,2011,（09）：3492-3504.
[41]Huang QY,Li GH,Kung AW. The-9247 T/C polymorphism in the SOST upstream regulatory region that potentially affects C/EBPalpha and FOXA1 binding is associated with osteoporosis[J].Bone,2009,（02）：289-294.doi:10.1016/j.bone.2009.03.676.
[42]Deal C. Potential new drug targets for osteoporosis[J].Rheumatology,2009,（01）：20-27.
[43]Marsell R,Sisask G,Nilsson Y. GSK-3 inhibition by an orally active small molecule increases bone mass in rats[J].Bone,2012,（03）：619-627.
[44]Gambardella A,Nagaraju CK,OShea PJ. Glycogen synthase kinase-3alpha/beta inhibition promotes in vivo amplification of endogenous mesenchymal progenitors with osteogenic and adipogenic potential and their differentiation to the osteogenic lineage[J].Journal of Bone and Mineral Research,2011,（04）：811-821.