超声辅助脱细胞脊髓支架的生物学特性研究

组织工程从 1987年在美国华盛顿提出至今,取得了迅猛的发展,人们开始认识到组织工程脊髓有可能治疗脊髓损伤。组织工程脊髓的构建中,种子细胞的选择、 支架的构建以及种子细胞与支架的复合,是其成功构建的三个重要因素[12],其 中支架材料的构建是关键。同种异体脱细胞脊髓支架由于具有与正常脊髓最为相似的三维网状结构以及良好的生物相容性等优点,使其成为支架材料的优先选择之一[3]。 有研究表明,超声波具有质点加速产生的机械作用,热效应和空化效应等能将细胞破坏、 溶解,并加速破碎细胞及其内容物的溶解释放[4，5]。有学者采用超声振荡的方法能成功制备出脱细胞异种松质骨材料,并证明其抗原性较弱且具有良好的生物相容性[6]。 本课题组在前期化学萃取方法的基础上结合超声振荡技术成功制各出了脱细胞脊髓支架,该方法有效减少了脱细胞脊髓支架制备时间, 可有效提高脱细胞脊髓支架的制备效率,但所制各支架材料的组织结构、 理化性质等生物学特性缺乏深入认识。笔者将对该方法制备的大鼠脱细胞脊髓支架的相关特性进行初步研究,为进一步体内实验 奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器脱氧胆酸钠(北京奥博星公司),Triton Ⅹ~100 (北京奥博星公司),台 式恒温振荡器(THZ-” ,江苏太仓市实验设备厂),超声破碎仪(SonicsⅤCX- 750,美国),普通光学显微镜(Leim,德 国),扫描电子显微镜(Hitachi S-3400,日 本),电热恒温水槽 (DK-8B型 ,上海精宏实验设备有限公司)。 SD大鼠雌雄不拘,体重250~300g(第 三军医大学附属大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)。

1.2 实验动物分组及脱细胞脊髓支架制各 1.2.1 脱细胞脊髓组:SD大 鼠30只经20g/L戊巴比妥钠45mg/kg 腹腔麻醉后,取胸段脊髓,长约 20 mm,0.01mol/L PBS中 漂洗清除血迹,并 放入 —70℃深低温冰箱中冷冻保存。超声振荡结合化学萃取法制各脱细胞脊髓支架方案:(l)将脊髓组织于 -20℃、 4℃ 和 37℃ 梯度解冻;(2)双蒸水浸泡6h(4℃ );(3)体积分数 2%Triton Ⅹ-100溶液中超声振荡5血n(振幅25%,振 5s停 5s);(4)恒温回旋振荡器持续振荡3h(室温,转速200r/min); (5)0,01m。l/L PBs中 振荡漂洗 3h;(6)体积分数 2%脱氧胆酸钠溶液中超声振荡 5min;(7)恒温回旋振荡器持续振荡 3h;(8)0.01mol/L PBS中振荡漂洗 3h;(9)真空干燥,密 封,放 一⒛℃冰箱 中保存。 1.2.2 正常脊髓组 (对 照组):SD大 鼠 30只 经 ⒛g/L戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔麻醉后,取胸段脊髓,长约 ⒛ mm,0.01mol/L PBS中漂洗清除血迹, 并放入-7O℃ 深低温冰箱中冷冻保存。

1.3 形态学观察 1.3.1 大体观察:肉 眼观察大鼠对照组和脱细胞脊髓组组织的大体形态、 长度、 色泽、 质地等基本特征。 1.3.2 组织学观察:分别将两组脊髓组织用细 酽L 多聚甲醛固定,脱水,透 明,常规石蜡包埋,切片,HE 染色,光镜下观察细胞残留以及细胞外基质成分保留情况。 1.3.3 扫描电镜观察:将两组脊髓组织用 20 g/L 戊二醛固定,暴露观察面,并经梯度浓度乙醇脱水, 叔丁醇置换,临界点干燥,喷金处理后,观察支架材料的超微结构。

1.4 孔隙率测定采用液体置换法[7]测量孔隙率。将真空干燥的两组脊髓组织放人装有 Ⅴ 1体积无水乙醇的刻度试管中,反复轻轻挤压脊髓组织,直至无气泡溢出为止,此时的刻度为 Ⅴ 2,Ⅴ2-Ⅴ1表示脊髓组织的体积;将脊髓组织移出试管,此 时试管的刻度为 Ⅶ , Ⅴ 1-Ⅶ 表示脊髓组织中孔隙的体积;支架总体积为脊髓组织体积 +孔隙体积 =(Ⅴ2-Ⅴ1)十 (Ⅴ1- Ⅴ 3)=Ⅴ2-Ⅴ3,孔隙率=[ (Ⅴ 1-Ⅴ3)/(Ⅴ2-Ⅴ3)] ×IOO%。 每组各测6次,取其平均值。

1,5 含水率测定将真空干燥的两组脊髓组织分别称重,即 为干重(WI),置于0.01mol/L PBS中 浸泡 2h(25℃), 再将其放于铺有滤纸的倾斜玻璃板上,待 吸出多余水分后称取湿重 (W2)。 含水率 =(W2-W1)/ WI[8]。 每组各测 6次,取其平均值。

1.6 体外酶降解实验将真空干燥处理后的两组脊髓组织分别称重 (W1)。 将其分别放人20ml PBs(pH=7,3,含 1mg/ml胰蛋白酶)中 振荡(温度 37℃ ,转 速 120r/min)。 分别在4,8,12,16,⒛ h将其取出,并将样本真空干燥后称重(W2)。 计算脊髓组织的降解率, 降解率 〓[(W1-W2)/W1]× 100%[9]。 每组各测6次 ,取其平均值。 1.7 支架在水溶液中的失重率将真空干燥的两组脊髓组织分别称重(W1)。置于双蒸水中持续振荡(室温,I20'mh),于第 1, 2,3,4,5,6,7,8天 分别取出标本,真空干燥后称重 (WV。 失重率 =(W1— W2)/Wl× 100%[10]。 每组各测 6次 ,取其平均值。

1.7 统计学分析数据以X± s表示,应用 SPSS 13.0统计软件,采用单因素方差分析及检验,P<0.05为有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察 2,1.1 大体肉眼观察:正常脊髓组织呈圆柱状,颜 色呈乳 白色. 脱细胞后的脊髓组织呈圆柱状, 长度略有缩短,颜色呈乳白色半透明状,强度有所下降,黏性略有增加 ;两者硬脊膜均保持完整(图 1,2)。 2,1,2 组织学观察:正常脊髓组织细胞结构紧密,含有大量神经细胞和髓鞘(图 3)。 脱细胞脊髓组织呈网状结构,细胞去除较为彻底,细胞外基质成分保留相对完整(图 4)。 2.1.3 扫描电镜观察:可见正常脊髓组织横断面结构紧密,未见明显孔隙结构(图 5);正常脊髓组织纵切面组织皱缩明显,未见三维立体网状结构(图 6)。对 比可见脱细胞处理后的脊髓组织横断面脱细胞后孔隙得以保存,孔径大小分布在 16~95um,平均弱 um(图 7);脱细胞处理后纵切面内部具有纵向平行或不规则排列的孔道系统,各通道之间互相沟通形成三维立体网状结构图

2.2 孔隙率测定经测定正常脊髓组孔隙率为 0,03%、0,01%、 0.07%、0.05 %、0.03%、0.02%,平均0.04%;脱细胞脊 髓 组 孔 隙率 为 91,3%、 93.6%、94.3%、 90.2%、99.8%、98.2%,平均94.6%,两 组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 含水率测定经测定正常脊髓组的含水率为62.1%、61.2%、 63.5%、63.4%、60.1%、64.3%,平均62.4%;脱细胞脊髓组 的含水率为 87.8%、 89.6%、 881%、 90..2%、87,3%、 88.7%,平 均88.6%,两 组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2,4 体外酶降解实验正常脊髓组在第 4,8,12,16及20 时所测得的酶解率分 别为 (8.86± 0.94)%、 (12.98± 1.16)%、 (19.35± 0.87)%、 (21.18± 0,85)%、 (37.62±0.99)%;脱细胞脊髓组在第 4,8,12,16 以及20小时所测得的酶解率分别为 (11.22± 0.63)%、 (24.62± 1.27)%、 (3340± 1.22)%、 (6.68± 0.85)%、 69.03± 2.19)%。 正常脊髓和脱细胞脊髓可在胰酶溶液中逐渐酶解,到 第20小` 时,正常脊髓组酶解率为(37.62±0.99)%,脱细胞脊髓组酶解率为(69.03± 2.19)%,两 组间差异有统计学意义(P<0.05)。 见图9。

2.5 支架在水溶液中的失重率正常脊髓组在第 1,2,3,4,5,6,7,8天水溶液中失重率为 (4,63± 0,10)%、 (9.71± 0,10)%、 (16.57± 1.01)%、 (20.63± 1 .22)%、 (28.35± 0.86)%、 (33,02± 1.63)%、 (38.58± 0,93)%, (40.97±0,81)%;脱 细胞脊髓组失重率分别为: (11.60± 0.86)%、 (28.42± 0.73)%、 (38.I5± 0.90)%、 (39.90± 3.10)%、 (45.45± 2.60)%、 (51,40± 1.14)%、 (57.38± 1.40)%、 (62.55± 1.70)%。 正常脊髓和脱细胞脊髓支架在水溶液中逐步水解,到第8天,正常脊髓组失重率达(40,97± 0.81)%,脱 细胞 脊 髓 组 失 重 率 达 (62.55± 1.70)%,两 组间差异有统计学意义(P<0.05)。 见图 10。

3 讨论

当前常用的脱细胞技术包括去污剂处理法、 酶处理法、 物理处理法等。去污剂处理法主要包括:脱 氧胆酸钠、 Thton Ⅹ-100和十二烷基磺酸钠等;酶处理法包括:胰 蛋 白酶、 核酸酶等;物理处理法主要包括:反复冻融、 超声破碎、 机械振荡和反复高低渗等。脱细胞技术已在组织工程角膜[11]、 食管[12]、 周围神经[:]、真皮基质[14]、 骨[15]等组织中广泛应用。不同组织的胶原成分、细胞成分等不同,针对不同组织器官需谨慎选用脱细胞方法。针对脊髓组织,既往脱细胞方法尚不完善。超声波具有质点加速产生的机械效应、 热效应和空化效应,能对生物组织细胞产生破坏效应,从 而起到辅助脱细胞的作用[16]。 有学者通过反复冻融配合超声振荡洗涤成 功制各出了猪脱细胞真皮基质[17 ]。本研究中通过超声结合化学萃取脱细胞方法成功制各了脱细胞脊髓支架,经过反复摸索,发现梯度解冻 +体积分数 2%Trition Ⅹ-1OO+体积分数2%脱氧胆酸钠 十超声破碎的综合处理方法能有效脱去脊髓组织内的细胞成分且相对完整地保留细胞外基质。Guc 等[3]通过 单纯化学萃取法制各脱细胞脊髓支架时间共需 31h。

笔者在超声辅助下制各脱细胞脊髓支架时间仅需 19h20min,共计节约11h40min明显缩短了脱细胞处理时间,提高了制各效率。另有研究显示, 过长的脱细胞处理过程会加重脱细胞组织的自然降解[10]。因此,超声结合化学萃取法制各脱细胞脊髓支架不仅缩短了脱细胞时间,并利于更好地保存其细胞外基质成分的完整。理想的组织工程脊髓支架应具有良好的生物相容性、 理想的三维空间结构、 较高孔隙率及可降解特性等特点[18]。 在本研究中,对 比脱细胞前后脊髓组织的HE染色结果显示,经过超声结合化学萃取方法制备的脱细胞脊髓支架细胞成分脱除彻底,细胞外基质成分保留相对完整。有研究表明,组织移植所致的免疫排斥反应主要 由组织相容性复合体 (MHC)引 起,而细胞膜上的膜抗原主要由MHC的产物所构成,故脱除细胞的程度在理论上可以最大限度降低该移植物的免疫原性[19 ]。 Baraki等 [20]通过去污剂处理绵羊大动脉瓣膜,成功构建了脱细胞心瓣膜,并通过体内实验证明其具有较低免疫原性。郭树章等[21]的研究表明,通过脱细胞处理的脊髓支 架具有较低免疫原性。因此,脊髓组织经脱细胞处理后,可有效降低其免疫原性,为进一步体内移植打下基础。本研究中HE染色和扫描电镜结果显示,超声结合化学萃取方法制各的脱细胞脊髓支架具有良好的三维空间结构且孔径大小分布在 16~95um(平均46um),孔隙率为(94.57± 30.45)%。

有研究表明,理想的孔径能在一定程度上促进细胞与支架的结合,较高的孔隙率可增加材料的内在表面积,利于细胞贴附、 增殖、 生长及迁移,同 时在植人脊髓损伤局部时能保证营养物质的吸收以及代谢产物的排除[22]。同时本研究结果显示,该支架具有较高的含水率,具有良好的亲水性,有利于细胞黏附。因此, 超声结合化学萃取制各的脱细胞脊髓支架具有良好的三维立体空间结构及良好的亲水性。该支架在体外模拟酶解环境中酶解率以及水溶液中失重率检测表明,该支架具有良好的降解特性, 在组织形成过程中逐渐分解吸收,而不影响新形成组织的结构与功能。但是本研究结果表明,该支架降解速度相对较快,与轴突的生长速度不相适应。 有研究表明,通过京尼平、 戊二醛以及多聚环氧化合物等对脱细胞支架材料进行交联,可增强该支架的生物稳定性,同 时还可降低其抗原性[23]。 Wang 等[24]研究发现,京尼平交联的支架生物稳定性明显增加,而且交联后支架降解速度明显减慢。因此,笔者下一步准各尝试通过化学交联剂对脱细胞脊髓支架进行交联,提高该支架的生物稳定性,减慢其降解速度。

总之,本研究通过超声辅助化学萃取法制各出的脱细胞脊髓支架细胞成分去除彻底,细胞外基质成分保留完整,具有良好的三维空间网状结构、 较高的孔隙率和理想的孔径,且含水量丰富,具有可降解特性。但如何减慢其降解速度,仍有待进一步研究。

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