补肾助孕汤对小鼠生殖能力影响的实验研究

尽管体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization-em bryo transfer , IVF-ET)技术及超排卵药物有了长足进步，但其胚胎种植率仍未令人满意，影响种植的关键为胚胎质量和子宫内膜容受性。如何改善子宫内膜容受性，提高种植率是目前需要解决的问题。已有研究发现，白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF),表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)[4-6]、降钙素(calcitionin , CT) [7,8]等细胞因子在子宫内膜容受性或胚胎种植的窗口期起至关重要的作用，而传统中医药在不孕症治疗方面曾起到重大的作用。本研究依据中医“肾藏精，主生殖”和 “调经种子”理论，通过动物实验探讨《中医妇科学》[9] 所载方剂补肾助孕汤对小鼠生殖能力的影响，为临床应用提供理论依据。

材料与方法

1动物清洁级昆明雌性小鼠60只，由中国医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽) 2010 - 0009 , 8一12周龄，体重25一30 g，未交配。饲养:室温21 -22℃，湿度67%一75%，光照明暗时间比为，4 h/10 h，能自由获取食物和水。

2药物及制备补肾助孕汤方剂组成:紫石英、川芍、川椒、川牛膝、续断、当归、赤芍、白芍、淫羊霍、冤丝子、构祀子、香附、桂心、丹皮。全部中药购于天益堂大药房，经辽宁省中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定。按常规煎药法制备，并将所得药液过滤，含生药 267 m g/m L，相当于60 kg成人用药等效剂量，存于 4℃冰箱待用。

3试剂及仪器兔抗人LIF ( BA1239 ) , EGF, CT单克隆抗体，生物标记素标记的羊抗兔IgG(武汉博士德)，即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒 (武汉博士德);血清雌二醇、孕酮放射免疫检测试剂盒购于美国DPC公司。光学显微镜，日本NIKON;美国DPC GAMBYT10探头，记数器;岛津UV-2600 型紫外可见分光光度计;Bioteck全自动酶标仪;M I- SA300多媒体图像分析系统。

4分组及给药采用完全随机分组方法，将小鼠分为实验组(30只)和对照组(30只)，实验组进一步分为实验1组(给药10天，15只)和实验2组(给药 20天，15只)。以生药剂量比根据文献仁[10]折算，依照成人单位体重生药量求得小鼠单位体重用药剂量后，再扩大10倍给药，亦即2. 67 g/( kg·d)，实验组小鼠每天2次(6:00和18:00)经鼠胃管灌注;对照组常规饲养，每日于同一时间给予同体积生理盐水灌胃。

5标本采集分别于给药10 ,20天后断颈处死实验组和对照组小鼠，每组每次15只。实验组和对照组均心脏取血;横向剪开腹壁，找到子宫及卵巢，观察并记录对照组及实验组子宫、卵巢形态，并称重，所取组织用4%多聚甲醛固定，准备组织学检查和免疫组化检查。

6血清雌二醇和孕酮测定采用放射免疫法检测小鼠血清雌二醇和孕酮含量。分离血清，采用 GAMBYT10探头，记数器放免测定小鼠雌二醇及孕酉同水平。

7子宫、卵巢组织HE染色石蜡包埋所取组织后，切片至4 um厚度，再经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，苏木素染色8 min;之后水洗、盐酸乙醇化，再经伊红染色1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后以中性树脂封片。

8免疫组化法测定子宫内膜LIF, EGF和CT 表达.

8. 1操作步骤切片常规脱水，蒸馏水10 min 室温洗3次后，浸人0. 01 mol/L拘椽酸盐缓冲液，加热至沸腾，间隔5 min，再浸人构椽酸盐缓冲液内;冷却后，以0. 1 mol/L PBS洗涤2次，加抗原修复液I 室温10 min,0.1 mol/L PBS洗涤3次，滴11羊血清封闭室温40 min。之后将切片分别滴加兔抗人LIF, EGF,C丁单克隆抗体，4℃过夜，0. 1 mol几PBS洗涤 2 min 3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37℃ 30 min ,0. 1 mol/L PBS洗涤2 min 3次。滴加试剂 SABC,37 0C 20 min,0.1 mol/L PBS洗涤5 min 4 次，应用DAB显色试剂盒，室温显色。洗涤，苏木素轻度染色30 s，水洗、酒精梯度脱水、透明、中性树脂封闭，显微镜观察拍照，并以尸BS代替一抗和二抗作为空白对照。

8. 2结果判定染色结束或在阴性对照无特异性着色情况下对切片进行判读，阳性细胞必须符合下列要求:(1)棕黄色颗粒为特异染色。镜下组织细胞结构清楚，阳性颗粒定位好，染色明显高于背景。(2)通过MISA300多媒体图像分析系统进行分析:每张切片用显微镜摄像头(200 x)随机选取5 个区域，将图像输入计算机，以阳性细胞灰度值代表染色强度，以任意单位U表示，反映CT、EFG,LIF的含量。

9统计学方法应用SPSS 17. 0软件包，计量资料以万士s表示，进行单因素方差分析，P< 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组小鼠子宫和卵巢重量比较(表1)实验，组和实验2组小鼠子宫和卵巢重量较对照组同期明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05,P <0.01)，且实验2组优于实验1组(P < 0. 05)。 2各组小鼠性激素水平比较(表们实验1组和实验.

2组小鼠血清雌二醇和孕酮水平均明显高于对照组同期，差异有统计学意义(P <0.05,P <0.01)，且实验2组优于实验1组(P< 0. 05)。

3各组小鼠子宫和卵巢形态学比较(图1)实验组小鼠子宫内膜腺体数目增加，局部腺体增大，腺腔扩大，腺体上皮细胞核数目增加，子宫内膜增生，复层排列，间质细胞增多;对照组小鼠子宫内膜腺体和间质细胞清晰，子宫内膜完整。实验1组及实验2组小鼠卵巢增大，初级卵泡、次级卵泡数均增多，间质细胞轻度黄素化，以实验2组最为明显;对照组小鼠卵巢初级卵泡、次级卵泡清晰，未见黄素化现象。

4各组小鼠子宫内膜LIF, EGF和CT表达比较 (表2，图2)在小鼠子宫内膜中U只EGF表达于腺上皮细胞及基质细胞浆中，呈棕黄色颗粒，LIF表达以腺上皮细胞为主。实验1 ,2组小鼠腺上皮细胞及基质细胞浆中LIF,EGF表达较对照组同期明显增强(P <0.01,P <0.05)，且实验2组优于实验1组 (P<0.05)。在小鼠子宫内膜中C下表达于腺上皮细胞浆中，呈棕黄色颗粒:实验，,2组小鼠C丁表达较对照组同期增强，差异有统计学意义(P< 0. 01)，且实验2组优于实验1组(P < 0. 05)。

讨论

根据中医“肾藏精，主生殖”和“调经种子”等理论，采用补肾助孕汤其宗旨系在于“补肾、活血、化癖及调经”。方中重用紫石英，《本草便读》云，紫石英温营血而润养，可通奇脉，镇冲气之上升，故本方用其温肾暖宫。现代认为，紫石英主要化学成分是氟化钙 (CaF2)，有兴奋卵巢分泌功能，而且紫石英具有雌激素样作用，并可升高雌激素水平，使育龄妇女基础体温由单相型转变为双相型[ 12,13]。此外，药理研究证实，当归对子宫有双向调节作用，可调整子宫收缩节律，加速子宫的血液循环，确保子宫的供血供氧;当归还可以使体内前列腺素维持正常水平。香附对子宫有抑制其收缩、缓解其痉挛的作用。川芍、桂心、丹皮可改善微循环，川芍还可提高机体的耐缺氧能力。 就方剂整体而言，国内的研究已经证明，补肾助孕汤可明显提高不孕妇女血浆中黄体生成素(luteini- zing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimula- ting hormone, FSH)的含量[s7，而FSH不仅能刺激卵泡生长发育，在少量LH参与下，还可使发育的卵巢泡分泌雌激素。与本研究观察到的卵巢重量增加以及雌二醇、孕酮含量增加的结果相吻合。

尚有研究显示，中药补肾方剂可以从促进子宫内膜腺体和间质发育同步，促进卵巢黄体细胞的增生和改善黄体细胞的发育，提高黄体功能[15]。吴云霞等[16]对小鼠子宫内膜容受性进行研究发现，中药补肾益气活血汤通过其雌激素样活性，加强雌激素与其受体相互作用，使子宫内膜蜕膜化来促进着床。陈秋梅等[17]对排卵障碍性患者应用调经孕育方药治疗，经治疗后刮取子宫内膜进行组织学观察发现，调经孕育方药可明显改善子宫内膜容受性，促进内膜组织增殖和分泌。丁彩飞等[18]· 运用助孕汤补肾温阳、养血活血，增加IVF-E丁患者因克罗米芬引起的抗雌激素作用的内膜厚度，促进子宫内膜血流状况，从而提高妊娠率。夏誉薇等[19]:研究发现女贞孕育汤可养血补肾，使子宫内膜增殖，且雌、孕激素受体、EGF受体等的表达明显增强。而本研究也发现补肾助孕汤可以促进子宫和卵巢的发育，促进子宫内膜腺体的发育，增加各级卵泡数目。 探讨补肾助孕汤与LIF, EGF及CT这一类细胞因子的关系，是本研究的亮点之一。近来发现，LIF在不明原因所致的不孕症妇女中起关键作用，Mariee N 等[20]发现IVF反复失败的妇女子宫内膜腺上皮LIF 表达水平较正常妇女低，Aghajanova L等也发现不明原因不孕妇女的LI「通路受阻。关于CT[22]，主 要由甲状腺滤泡旁C细胞合成并分泌，是两端高度保守单链多肤激素，由32个氨基酸组成的，其生物活性区集中在第3一6位氨基酸序列中，而Palomba S 等[23]的研究提示，CT可能通过自分泌或旁分泌方式促进细胞外Cat+内流，降低宫腔Cat+水平，而增加间质细胞内Cat+浓度，并通过钙调蛋白，促进子宫内膜间质细胞从G1期进人S期，从而促进蜕膜的生长分化;体外培养时加人Cat2+，能促进上皮细胞间紧密连接的形成，反之，则松持。LiHY等[24]'研究着床期子宫内膜上皮细胞向滋养层细胞发生过程时发现，CT是通过钙离子和蛋白激酶C达到促进此过程的作用的。

Zamah AM等在研究LH激发的排卵过程中 EGF样生长因子的作用时，认为人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG)敏感的患者成熟卵泡液中含大量EGF样生长因子的双调蛋白。而在LH高峰前和体外颗粒细胞培养应用HCG之前均检测不到这类双调蛋白，说明EGF样生长因子需要促性腺激素的刺激。受激素刺激的卵泡液可以使卵丘膨大、卵泡成熟。应用免疫耗竭卵泡液中的EGF样生长因子将无法使卵丘膨大、卵泡成熟。不成熟的卵泡液和发育成畸形胚胎的卵泡液中EGF样生长因子远远少于正常成熟卵泡液。由此推论，EG「样生长因子对卵细胞成熟，甚至排卵起重要作用。本研究发现补肾助孕汤可以明显增加EGF在小鼠子宫内膜的表达，且发现补肾助孕汤可以增加卵巢重量，卵巢各级卵泡增多，雌二醇和孕酮也有提高，提示补肾助孕汤可以促进卵泡的发育和激素分泌。 本研究结果证实，补肾助孕汤可促进小鼠生殖系统的发育及雌二醇、孕酮的分泌，增加LIF, EG只CT 在子宫内膜的表达，且与用药时间有相关性;从组织学、细胞学角度探讨了补肾调经中药对靶器官的作用，证明补肾助孕汤可以提高子宫内膜的容受性，有利于胚胎着床和发育。为补肾助孕汤用于改善子宫内膜容受性的临床治疗提供了实验依据。