甲状腺微小乳头状癌的形态学和免疫组织化学研究

甲状腺微小乳头状癌的形态学和免疫组织化学研究
作者：任玉波　周庚寅　张学东　李玉红　贾爱华　董新茜    作者单位：1山东省聊城市人民医院　病理科　（山东　聊城　252000） 2山东大学齐鲁医院　病理科　（山东　济南　250012）
   【摘要】  目的：观察甲状腺微小乳头状癌的临床病理并检测其免疫表型，探讨相关疾病的鉴别诊断。方法：光学显微镜下观察223例甲状腺微小乳头状癌的组织形态；对74例甲状腺微小乳头状癌、32例甲状腺增生性病变行免疫组织化学方法标记细胞角蛋白19（CK19）、间皮细胞（MC）、细胞黏附凝集素3（Galectin-3）、CD56，复习相关文献。结果：在223例甲状腺微小乳头状癌中以滤泡状排列为主者占38.6%（86/223），核的特征不典型者占13.9%（31/223）。在74例甲状腺微小乳头状癌中CK19、MC、Galectin-3、CD56阳性表达率分别为100.0％、98.6%、98.6%、4.1%；在32例增生性病变中4者阳性表达率分别为37.5％、12.5%、18.8%、68.8%。结论：部分甲状腺微小乳头状癌细胞以滤泡状排列为主，核的特征不够典型，诊断较为困难。根据滤泡细胞增生活跃，细胞核具有乳头状癌的基本特点，病变与周围滤泡截然不同，且肿瘤性滤泡穿插于硬化间质或正常滤泡之间，可与增生性病变鉴别。CK19、Galectin-3、MC弥漫性中强阳性表达，CD56阴性表达对其诊断有重要价值，联合应用可以提高诊断的准确性和特异性。
    【关键词】  甲状腺肿瘤·癌，乳头状·微小癌·细胞角蛋白19·半乳凝素-3·上皮·分化抗原簇56·免疫组织化学
    Immunohistochemical and morphological characteristics of the papillary thyroid microcarcinoma 　REN Yu-bo, ZHOU Geng-yin, ZHANG Xue-dong, LI Yu-hong, JIA Ai-hua, DONG Xin-qian　1Department of Pathology, People’s Hospital of Liaocheng （Liaocheng 252000, China）2Department of Pathology, Qilu Hospital of Shandong University （Jinan 250012, China）
　　【ABSTRACT】 Objctive: To investigate the immunohistochemical and morphological characteristics of the papillary thyroid microcarcinoma(PTM), and differential diagnosis of the related disease. Methods: The morphological characteristics of 223 patients with PTM were observed under light microscope. Seventy-four cases of PTM and 32 cases of proliferative lesion of thyroid were observed under light microscope with stains of hematoxylin and eosin and immunohistochemical staining. The antibody included CK19, MC, Galectin-3 and CD56. Results: Eighty-six cases were follicular-patterned and 31 cases nuclear features were untypical in 223 cases of PTM. The positive expression rates of CK19、MC、Galectin-3、CD56 were 100.0%, 98.6%, 98.6% and 4.1% in 74 cases of PTM, and were 37.5％, 12.5%, 18.8%, 68.8% in proliferative lesion of thyroid, respectively. Conclusion: Some cases of PTM show a follicular-patterned and the nuclear features. It is untypical compared with classical papillary thyroid carcinoma. It can be differentiated from proliferative lesion with absence of envelope, obviously various and unusually proliferated follicular cells, sclerotic stroma, neoplastic follicles among the collagen and normal follicles. The wide and intensive expression of CK19, Galectin-3, and the negative expression of CD56 are extremely useful in the diagnosis of PTM, four-marker panel with CK19, Galectin-3, MC and CD56 can improve the specificity and accuracy of the differential diagnosis of PTM.
　　【KEY WORDS】 Thyroid neoplams·Carcinoma, papillary·Microcarcinoma·Cytokeratin 19·Epithelium·Cluster differentiation 56
　　甲状腺微小癌是指直径1 cm以下的甲状腺癌，其中绝大多数是甲状腺乳头状癌（papillary thyroidcarcinoma，PTC），称为甲状腺微小乳头状癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTM）。随着健康体检工作对甲状腺疾病的重视和超声引导下甲状腺结节细针抽吸细胞学技术的日臻成熟和广泛开展，PTM的检出率逐渐升高，手术切除的肿瘤越来越微小，病理诊断越来越困难。观察PTM的病理组织学特点，寻找特异性标志物，建立可靠、可行的检测手段，对于甲状腺肿瘤的早期诊断具有重要临床价值。近年来关于PTC的免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）研究已有较多报道，主要是细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）、细胞黏附凝集素3（Galectin-3）、E-钙粘连素（E-cadherin）、HBME-1等抗体［1］，关于间皮细胞（mesothelial cell，MC）、CD56的报道较少。本研究复习相关文献，探讨PTM的病理组织学和免疫表型特点及其鉴别诊断。
1　材料与方法
　　1.1　材料　
　　收集聊城市人民医院病理科2006年1月—2008年12月行甲状腺手术患者的病理标本1 491例。3名病理医师复查所有病例。其中PTC 441例， 符合PTM者223例，其中男28例，女195例，男女之比为1∶6.96。年龄为20～78岁，平均年龄45.7岁。选取32例甲状腺增生性病变（包括腺瘤样增生26例、乳头状增生6例）作为对照组，74例PTM作为研究组，进行IHC检测。
　　1.2方法　
　　所有病例均经4%甲醛固定，组织块由全自动脱水机处理。IHC预实验选取经典型PTC、滤泡型PTC、增生性结节各4例制备组织芯片，分别行48种抗体IHC检查，包括常用抗体和科室常备抗体。针对预实验结果选取CK19、MC、Galectin-3、CD56作为实验抗体。采用即用型非生物素ElivisionTM Plus检测试剂盒，所用单克隆抗体均购于福州迈新生物技术开发有限公司，按产品说明书步骤进行染色操作。PBS替代一抗作为阴性对照。
　　1.3  PTC的组织学观察指标　
　　肿瘤大小、生长方式、组织结构、核的特征、细胞质表现等。
　　1.4  PTC的诊断标准
　　主要诊断指标：核变大、拉长，呈卵圆形；核拥挤、重叠、极向紊乱；毛玻璃样核；核不规则，核沟明显，核内包涵体。次要诊断指标：流产型乳头（abortive papillae）；明显拉长或不规则的滤泡；浓缩的胶质；砂粒体；滤泡腔内多核组织细胞。出现至少3个主要指标，或2个主要指标+至少4个次要指标可诊断为PTC。
　　1.5　IHC结果判定　
　　CK19、Galectin-3均为细胞质染色，MC、CD56均为细胞膜染色。参考Beesley［2］的评分方法：染色强度依次为无色0分、淡黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分；染色范围以阳性细胞所占百分比打分，未见阳性染色为0分、阳性细胞<25%为1分、25%～50%为2分、＞50%为3分。染色强度与染色范围的和即为IHC反应结果，积分为0判为阴性，1～2分判为“+”，3～4分判为“++”，5～6分判为“+++”，阳性表达包括“+～+++”。
　　1.6　统计学处理　
　　采用SPSS13.0统计软件包进行分析，率的比较采用χ2检验，以P<0.01为差异有统计学意义。真实性指标计算方法：灵敏度Se=a/（a+c）；特异度Sp=d/（b+d）；准确度=（a+d）/（a+b+c+d）。其中a为真阳性例数，b为假阳性例数，c为假阴性例数，d为真阴性例数。
2　结果
　　2.1　形态学特征　
　　在223例PTM中，结节大小为0.1～1.0 cm。镜下呈放射状生长者84例，有部分包膜者139例。间质明显硬化者170例，无明显硬化者53例。以乳头状排列为主者137例；以滤泡状排列为主者86例，占38.6%，其中完全呈滤泡样排列者33例。滤泡细胞均增生活跃，穿插于瘢痕样间质或周围正常滤泡之间，并与周围滤泡对比鲜明。PTC核的特征典型者192例，占86.1%（图1）。核的特征不够典型者31例，占13.9%。在32例对照组中，以滤泡状排列为主者29例，以乳头状排列为主者3例。滤泡细胞增生较活跃，多数结节内可见萎缩的滤泡，结节与周围的滤泡对比不鲜明。少数病例核轻度不规则，其中偶见核沟者4例，灶性区呈毛玻璃样核改变者2例。细胞质均相对较少且淡染，未见鳞状化生改变，未见砂粒体和浓缩胶质改变。
　　2.3　免疫表型　
　　CK19、Galectin-3、MC及CD56在研究组中的阳性表达率分别为100.0%、98.6%、98.6%和4.0%，而在对照组中，4者的阳性表达率分别为37.5%、12.5%、18.8%和68.8%。2组比较差异有统计学意义（χ2=57.00，83.43，75.12，51.88，P均<0.01，表1）。CK19、Galectin-3、MC的阳性表达见图2。
　　2.4　4种抗体的灵敏度、特异度和准确度比较　
　　根据统计学处理中的公式计算CK19、Galectin-3、MC及CD56的灵敏度、特异度和准确度，结果见表2。
3　讨论
　　PTM是指偶然被发现的、直径1 cm或更小的PTC［3］。这类肿瘤常贴近甲状腺被膜，伴有硬化，多无包膜。最小的PTM（<1 mm）常由滤泡构成，间质硬化和包膜浸润不明显。较大的PTM常有间质硬化，可出现乳头状结构，甚至全部由乳头构成，但较少见。本研究显示PTM有部分包膜者占62.3%（139/223），呈放射状生长者占37.7%（84/223），间质硬化显著者占76.2%（170/223），以滤泡状排列为主者占38.6%（86/223）。以滤泡状排列为主的病例比例远高于进展期PTC中滤泡型所占的比例，有包膜的病例多呈乳头状排列，呈放射状生长者多为滤泡状排列。核具有典型PTC的特征［4］，但部分病例核的特征不够典型（31例，占13.9%），尤其是完全呈滤泡状排列的病例，核的不规则性较轻，核沟、包涵体不易见到，核膜增厚不明显，核仁较小，病理诊断较困难。而某些增生性病变滤泡细胞增生较活跃，核轻度不规则，可见灶性区毛玻璃样核改变，甚至可见核沟或包涵体，间质也可以出现硬化和钙化。PTM（尤其是呈滤泡状排列者）需要与增生性病变相鉴别。其区别是PTM滤泡细胞普遍增生活跃，核普遍较大、变长、变卵圆、不规则，核沟和包涵体易见，核膜较厚，核仁较明显，细胞质普遍较丰富，细胞形态与周围滤泡细胞截然不同，肿瘤性滤泡在胶原化间质中呈浸润性生长，常见肿瘤性滤泡穿插于周围滤泡之间，并形成鲜明对比。
　　目前普遍认为CK19、Galectin-3、E-cadherin、HBME-1、ret/PTC等的阳性表达对诊断PTC意义较大［1］。CK19主要标记各种单层腺上皮，用于腺癌的诊断。多数文献报道CK19在PTC中呈细胞质弥漫强阳性表达，而在正常甲状腺组织、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤中不表达或灶性表达［5-7］，CK19是鉴别PTC的良好标志物［8］。滕晓东等［9］认为CK19阳性表达是滤泡细胞增生恶变的重要标志，不但可作为对甲状腺良、恶性的鉴别，尤其是对PTC诊断的重要依据，而且还可以提示恶变倾向。在甲状腺良性病变中，如果有少量腺体呈CK19中、强阳性而明显突出于背景滤泡，要仔细寻找原发灶，特别是微小PTC灶，以免漏诊。但Schelfhout等［10］认为CK19在PTC诊断中价值有限，其表达仅是增加了PTC的可能性。本研究74例PTM中CK19均呈弥漫强阳性表达（100.0%），增生性病变阳性表达率为37.5%，且均为灶性表达，提示CK19对PTC虽无特异性，但弥漫性强阳性表达对PTC的诊断有重要意义。
　　Galectin-3属凝集素（lectin）蛋白家族成员，最近报道Galectin-3过度表达与多种恶性肿瘤，如胃肠、前列腺、乳腺、甲状腺等肿瘤密切相关。Coli等［11］研究表明，Galectin-3在不同类型甲状腺癌组织中的表达有差异，其中在PTC组织中的表达率最高，在甲状腺滤泡癌组织中有较高的阳性率，在结节性甲状腺肿和滤泡性腺瘤组织中表达率较低，Galectin-3的表达与滤泡细胞的异型增生和恶变存在联系，其表达水平检测有助于判断良恶性。Sapio等［12］研究Galectin-3在62例甲状腺良性结节、74例PTC、32例滤泡癌中的表达率分别为27.0%、91.9%、75.0%，指出Galectin-3在鉴别诊断甲状腺良性、增生性病变和PTC中有一定的指导意义。本研究74例PTM中73例Galectin-3中强阳性表达，增生性病变组仅4例阳性表达，其诊断PTM的灵敏度、特异度和准确度分别为98.6%、87.5%和95.3%，是PTM诊断与鉴别诊断较为理想的抗体。
　　MC是用于间皮瘤诊断的相关抗体，用于甲状腺病理诊断的报道尚少。文献报道MC在PTC中呈高表达，是诊断PTC的较好标志物［13］。王仪等［14］研究20例结节性甲状腺肿、50例甲状腺腺瘤、100例PTC和8例甲状腺滤泡癌，MC表达率分别为25.0%、50.0%、100.0%和87.5%，MC在PTC中敏感性更高，癌与非癌组比较差异有统计学意义（P<0.01）。本研究中MC的灵敏度为98.6%，准确度为93.4%，特异性81.2%，提示MC在PTM诊断中特异性较差，需结合其他指标综合判断。
　　CD56是神经细胞黏附分子，主要用于视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤等肿瘤和NK细胞的研究［15］。其在甲状腺肿瘤诊断中的应用罕见报道。Demellawy等［16］研究75例甲状腺癌（72例PTC、2例滤泡癌、1例嗜酸细胞癌）、35例腺瘤（32例滤泡型、3例嗜酸细胞型）和65例非肿瘤性病变（25例结节性甲状腺肿、5例Grave病、19例淋巴细胞性甲状腺炎、6例桥本甲状腺炎、10例非甲状腺疾病切除的正常甲状腺组织），以滤泡上皮CD56阳性＞10%者为阳性表达，结果显示除PTC（包括乳头状型、滤泡型）外，其他各组病变均阳性，其诊断PTC的敏感性和特异性均为100.0%，指出CD56是诊断PTC非常有意义的抗体，特别是在鉴别滤泡型PTC和其他滤泡性肿瘤中具有重要意义。本研究显示，CD56在PTM中3例阳性表达，在增生性病变中22例表达，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），CD56诊断PTM的敏感性为68.8%，特异性为95.9%，准确性为87.7%，提示CD56在PTM的鉴别诊断中具有一定的意义。
　　综上所述，部分PTM以滤泡状排列为主，核的特征不够典型，需要与增生性病变相鉴别。根据病变滤泡细胞普遍增生活跃，细胞核具有PTC的基本特点，肿瘤性滤泡穿插于硬化间质或周围滤泡之间，并与周围滤泡形成鲜明对比，多数病例可确诊。CK19、Galectin-3和MC弥漫性中强阳性表达和CD56不表达，对于PTM诊断有重要价值，联合应用4种抗体可以增加PTM诊断的特异性和准确性。
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