纳米Ag-SiO2颗粒对小鼠成纤维细胞（L-929）的毒性研究

随着纳米技术的发展，核壳结构纳米复合材料成为复合材料、纳米材料等领域研究的热点日。纳米Ag- SIV:颗粒因其同时具有光谱抗菌性能的银[2,3]和拥有生物相容性的二氧化硅[[4,5]为口腔抗菌材料提供了一个良好的选择。本实验通过纳米Ag-Si02颗粒对L-929 细胞进行体外细胞毒性研究，为其在生物医学领域的应用提供依据。

材料和方法

1材料

小鼠成纤维细胞L-929购自中科院细胞库。DMEM培养基及FBS(胎牛血清)购自美国Gibc。公司;胰蛋白酶购自美国 Sigma公司;CCK-8试剂盒购自口本同仁化学研究所;乳酸脱氢酶比DH)试剂盒购自德国罗氏公司。

2方法

2.1细胞培养 L-929细胞于10%胎牛血清.10X104 U/1青霉素,100 mg/L链霉素低糖DME VI培养基中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养，侮2-3 d用胰酶消化传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

2.2纳米.fig-SiOZ透射电镜观察 将自制的纳米Ag-SIOz粉末[C6]放入无水乙醇中分散，在超声发生器中振荡10min，然后用胶头滴管将得到的悬浊液滴到 TEV专用碳支持膜，自然干燥，在Philips CR}I12型透射电镜上进行微观组织结构观察，加速电压为120 kV.

2.3细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察:将L-929细胞按8 X I0}/孔接种于 9C孔板中，过夜换液，加入含小同浓度纳米颗粒的培养液 <6.25,12.5 , 25 ,50,100 ug / mL)设空白对照孔，在24 h时倒置相差显微镜下观察细胞形态、拍照。

2.4 CCk-8法检测细胞存活率 取对数生长的L-929细胞接种于%孔板中，过夜换液，加入含不同浓度纳米颗粒的培养液，每个浓度设4个复孔①空白孔，少之加完全培养液;②对照组，不加材料;③实验组，分别培养 24,48,72 h后，每孔加入CCI<-8 10ul，摇匀，CO2温箱继续培养4h。在酶标仪上测} 450 nm处的吸光度值(A)，计算细胞存活率。 细胞存活率=(A实验孔一A空白孔)/ (A对照孔一A空白孔) 又100% 实验重复3次。

2.5lDH法检测细胞膜损伤 取对数生长的L-929细胞接种于孔板中，过夜换液，加人含不同浓度纳米颗粒的培养液，甸个浓度设4个复孔以不加材料的培养液为对照组，培养24 h后，按照试剂盒的说明进行操作，在酶标仪上测定490 nm处的吸光度(A>值，计算细胞毒性率。 细胞毒性率=0.05)，提示其细胞毒性有限(图3)。 4纳米Ag-SiO}颗粒对细胞膜的影响 乳酸脱氢酶(LDH)是胞质的标志酶，细胞正常时不能释出，只有细胞膜受损后才被释出细胞外液中，LDH活性是反映细胞膜损伤的较敏感指标。随着纳米入g复合SiO2颗粒浓度的增高，细胞毒性率也升高，表明细胞外液中LDH的活性逐渐升高(图 4)由此说明随着纳米Ag-Si02颗粒浓度的增高，其对细胞膜的损伤程度逐渐增大。而低浓度组对细胞膜损伤的程度与对照组 (细胞毒性率为0)相比，无统计学差异P>0.05)提示其生物相容性良好。

讨论

纳米银作为抗菌材料在医学领域有着广泛的应用前景，例如在口腔医学中，由于纳米银对口腔常见致病菌有杀灭作用，常被作为消毒剂添加到树脂基托、漱日水，牙膏或根管糊剂里，取得了良好的杀菌效果。纳米Ag-SiO2颗粒由于其独特的结构，既保留了纳米银的抗菌能力，而非晶硅壳又防止了内核的银被氧化，是制作抗菌材料的良好选择。但对于纳米尺度的生物效应，尤其是毒理学与安全性问题，目前尚无明确的结论。因此，有必要对纳米材料进行安全性评价。体外细胞毒性实验是用来评价材料对细胞生长状况影响的方法，是生物材料进入临床前的必要评价 本实验采用体外培养细胞系L-929细胞为受试对象，对纳米Ag-SiO2颗粒可能产生的生物学负面效应进行了观察。研究结果显示，纳米Ag-sio2颗粒对L- 929细胞有一定的抑制作用，倒置显微镜下观察细胞活性和形态发生变化:对照组与低浓度组细胞呈梭形，贴壁，生长活跃而高剂量组细胞皱缩变细长、变圆。在研究方法上通过CCK一8法发现，纳米Ag复合Si02颗粒暴露后，细胞增殖能力显著下降，并随着暴露浓度的升高和暴露时间的延长，细胞存活率逐渐下降。而低浓度组与对照组无明显差异，说明一定浓度以下的纳米 Ag-SiO2颗粒具有良好的生物相容性，月一经细胞形态学观察得以证实。此外，当细胞受损伤或死亡时位于细胞胞浆内的乳酸脱氢酶CLDH)可释放到细胞外，通过检测细胞培养液上清中LDH的活性，可判断细胞膜受损的程度 本实验结果显示，随着纳米Ag-SiO2颗粒浓度的增高，细胞膜的损伤程度加剧，对细胞产生的毒性升高。这可能是由于纳米颗粒吸附在细胞膜匕导致细胞膜的损伤、通透性的改变，从而对细胞的生存造成损害。而低浓度组一与对照组无明显差异，再次证实了该纳米材料在一定浓度以下，对细胞的毒性有限，具有良好的生物相容性。

综上所述，纳米Ag-SiO2颗粒的体外细胞毒性具有剂量一时间依赖关系，其细胞的毒性可能与细胞膜的损伤有关。当浓度在12.5ug / mL以下时，对L-929细胞无明显毒性，相对安全，为新型的抗菌修复材料的开发研究提供一定的依据。