类骨质羟磷灰石和自体骨修复兔下颌骨临界性骨缺损的研究

由于先天性畸形、外伤、肿瘤及炎症等原因造成的口腔颌面部骨缺损的修复，一直困扰着口腔修复医师。由于自体骨来源有限，以及收集自体骨所带来的一系 列并发症等原因，对骨替代材料的研究成为学者们一直追踪的热点。类骨质羟磷灰石是由羟磷灰石（hydroapatite，HA）与磷酸三钙 （tricalcium phosphate，TCP）复合构建的一种复合材料，本文采用的类骨质羟磷灰石（sinboneHT bone replacement，SBR）是HA/TCP以6∶4的比例合成的双相钙磷生物陶瓷，具有70%的高空隙率和平均粒径为500 μm的特点，易于组织长入、降解以及利于细胞黏附。关于类骨质羟磷灰石替代天然骨组织材料的研究很多，但其作为类骨质羟磷灰石替代材料仍有不足之处，即骨 组织改建时间长，尤其是需要即刻或早期负重受到限制[1]，为此很多学者在该类替代材料中引入骨髓基质干细胞，从而更快地修复骨缺损[1]。本实验拟用 SBR生骨替代材料和自体骨混合来探讨骨缺损的修复效果，采用临界性骨缺损（critical size de fect，CSD）动物模型进行检测，为临床应用奠定基础。
1  材料和方法
1.1  主要材料和仪器
SBR（台湾瑞安大药厂股份有限公司，粒度分别为0.5～1.0 μm），IX70倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）。
1.2  下颌骨临界性骨缺损[2-3]模型的建立
选取由四川大学华西动物实验中心提供的新西兰雄性大白兔12只，体重为2.0～2.3 kg。将12只新西兰雄性大白兔随机分为2、4、8周3组。实验动物称重后，采用846肌肉注射麻醉，脱毛备皮，于左下颌骨内侧做一长约1.5 cm切口，切开皮肤肌肉，显露下颌骨内侧面，用剥离子去除表面的骨膜，慢速裂钻滴水降温下切割，去除骨质，深度约为2 mm，扩大缺损，形成一个10 mm×10 mm×2 mm的临界性骨缺损，生理盐水冲洗，SBR和自体骨按照1∶1植入左侧骨缺损处，严密分层缝合肌肉皮肤，包扎伤口。右侧手术方法同左侧，但植入自体骨或是 缺如（其中2周组、4周组和8周组中1只实验动物右侧为植入自体骨；另外3只右侧植入物缺如，为骨缺如组）。术后给予实验动物普鲁卡因青霉素20万单位肌 肉注射，每天2次，共5 d。常规条件下喂养观察。
1.3  观察指标
在手术后第2、4、8周，采用耳缘静脉空气栓塞法处死动物，取下缺损区植入物连同周围骨质、骨膜，修整标本，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定， 拍X线片。然后将部分标本用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙，石蜡切片，然后行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）及Masson新三色染色；倒置相差显微镜下观察并拍片。
2  结果
2.1  大体标本的观察结果
标本固定后去除软组织，用探针探查骨缺损区。2周时，自体骨组和SBR组的骨缺损区均已被松散的纤维组织填满，均有皮肤与皮下组织粘连，炎症反应明显。
4周时，自体骨组和SBR组的骨缺损区已被致密的纤维组织填满，缺损边缘已与自体骨牢固愈合。
8周时，自体骨组和SBR组的骨缺损区新生组织与周围组织结合紧密，没有明显颜色的差别。骨缺如组的骨缺损区有大量的纤维组织充填，缺损四周均变光滑，类似软骨。
2.2  X线检查结果
2周时，自体骨组和SBR组可见材料的阻射影像，与正常骨组织界限清楚，密度均低于正常的骨组织；骨缺如组低密度影像区明显。
4周时，SBR组材料植入区密度升高，与正常骨组织的界限模糊；自体骨组密度阻射影像接近正常骨；骨缺如组低密度区明显。
8周时，SBR组缺损区密度与正常骨组织接近，缺损区内部有清晰的骨小梁，与正常骨组织的界限消失；自体骨组缺损区新骨界限不清，骨小梁明显，且密度接近正常骨组织；骨缺如组在缺损边缘可见区域性密度增高影像，但缺损中心部位密度较低。
2.3  组织学观察结果
2周时，SBR组和自体骨组有大量的成骨细胞长入材料之间的空隙，细胞呈多角形，胞核大而清晰，染色较浅，功能活跃；有的材料孔隙内也可见成骨 细胞成簇生长，细胞有多个突起附着于材料表面；成骨细胞之间充满红染的骨基质，在材料与骨组织交界处，大量骨基质将成骨细胞包埋其中；除成骨细胞外，还有 少量梭形的成纤维细胞、红细胞和胞核深染的炎症细胞散在。Masson染色可见，2组均有新形成的绿染骨基质，其中自体骨组骨基质绿染更多一些。骨缺如组 可见大量梭形的成纤维细胞长入缺隙之间，及大量的炎症细胞和交界处少量的成骨细胞，并分泌少量的骨基质，Masson染色呈淡绿色。
4周时，SBR组和自体骨组材料有部分溶解，成骨细胞分泌大量骨基质，包埋其中，形成骨陷窝，看不到成纤维细胞和炎症细胞。Masson染色可见绿色的骨基质，间或有少量红染的骨基质，其中自体骨组开始出现淡红染色带。
8周时，SBR组和自体骨组出现了大量新生骨小梁，有的骨小梁之间形成骨髓腔，骨髓腔内有成骨细胞、间充质细胞、淋巴细胞和少量的红细胞。 Masson染色结果可见骨小梁为淡绿色，有的骨质钙化明显，染色为淡红色。骨缺如组可见缺损区有少量新生的骨小梁形成，主要为纤维结缔组织（图1、 2）。
3  讨论
3.1  临界性骨缺损的建立意义
CSD包括皮质骨和松质骨全层缺损，通常状态下是自体不能完全修复[2-3]。CSD建模的目的是为排除自体骨自行修复的可能，检测骨替代材料 （bone repair materials，BRMs）在体内的修复效果[4]。本实验的骨缺如组第8周仍可见大量的结缔组织，说明所建缺损为CSD。
3.2  骨缺损建立的选取部位
通常骨的形成方式分为3种，即膜内成骨、软骨内成骨和混合型成骨。膜内成骨由间充质直接成骨，如头盖骨、面颅骨等。软骨内成骨是在软骨模型的基 础上成骨，即在软骨雏形形成后，软骨被破坏，再被化为骨组织，如四肢躯干骨（除锁骨以外）。混合型成骨是成骨（锁骨和下颌骨）先为膜内成骨，然后又出现软 骨内成骨[5-6]。由于口腔颌面缺损重建涉及到颅面部各部位，即同时涉及到膜内成骨和软骨内成骨。而下颌骨重建正好为混合成骨类型。实验中选取兔下颌骨 切嵴部位作为手术区，正是考虑到各部位的成骨类型不同，更能准确反应骨替代材料对颌骨缺损修复的影响。
3.3  骨缺损修复材料的选择
常用骨缺损修复材料有自体骨移植、人工骨替代等[7-8]。自体骨由于其良好的生物相容性一直作为修复材料的金标准。由于自体骨取材需要开辟第 二手术区，创伤大，手术感染机率增加，取材量有限，多数患者不愿意接受，使该方法受到一定限制。而人工骨材料来源广泛，无须开辟第二手术区，使用方便，被 患者和临床医生所接纳。常用的人工骨替代材料有HA、生物活性玻璃陶瓷（bioactive glass-ceramic，BGC）、TCP、HA/TCP双相钙磷陶瓷和牛脱蛋白骨[7-9]等。
3.4  SBR与自体骨混合后的修复评价
本实验选取的生物替代物SBR是一种类骨质羟磷灰石材料，具有天然骨组织结构，在形成完整骨骼后可获得良好的抗力性。粒度有0.5～1.0 μm、0.25～0.5 μm。化学式为Ca10（PO4）6（OH）2。材料内部孔系相互连接，利于成骨细胞的早期附着、迁入和骨基质的沉积。类骨质羟磷灰石材料在组织内的改建 需要一定时间，大约3～6个月才能达到良好的生物力学性能，而对于需要早期或即刻负重的修复就难以满足要求。骨髓间充质干细胞以及脱蛋白松质骨的引入有利 于骨组织的修复改建[1，10]。但骨髓间充质干细胞的培养需要一定的实验条件和技术，而自体松质骨来源相对简单，新鲜的松质骨内含有丰富的成骨细胞因 子，如转化生长因子（transforming grow-th factor，TGF）-β1、TGF-β2和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等。因此，将自体松质骨引入骨替代材料中会利于骨组织的改建。
本实验发现，早期2种粒度的SBR组均有成骨细胞长入材料之间的空隙及材料的内部孔隙，并有少量的成纤维细胞和炎症细胞，随着时间延长，成骨细 胞分泌骨基质并包埋其中，形成骨陷窝，出现板层骨；骨小梁比较成熟，出现整齐的同心圆状的哈佛系统，新生骨髓腔数量较多，基本具备了骨组织的正常结构。提 示SBR有良好的生物相容性和可降解性，不同粒度组之间未见明显形态学差异。Masson主要应用于胶原染色，成熟骨组织中的胶原着鲜红色，而幼稚骨组织 中的胶原主要着绿色。故采用这种染色方法可以清楚地看到新骨的形成情况。SBR组2周时材料之间充满成骨细胞，细胞周围有少量淡绿色的骨基质，材料与骨组 织交界处的骨基质较多；4周时，开始出现少量红染的骨基质；8周时，大部分骨小梁为绿色，表明骨小梁钙化成熟。与自体骨组相比，镜下骨基质没有明显差距。 实验结果提示SBR作为骨支架材料，能有效地促进骨缺损的修复愈合。自体骨的加入，缺损区成骨提前。该材料在骨修复后期被正常骨组织替代改建，提示其具有 较好的可降解性、骨引导和骨再生作用，是一种有前景的骨修复替代材料，而且自体骨的加入，更有利于缺损处的早期成骨修复。骨愈合的另一个关键评价指标是力 学性能[11]。骨缺损修复后能否在一定时间内达到基本力学要求，无疑是检测修复效果的重要评判标准。尽管本实验未做相关力学检测，但有学者在单独用类似 牛脱骨蛋白修复兔桡骨缺损时发现，16周后修复的骨缺损已经达到正常骨相近的力学性能[12]。提示本实验材料与自体骨混合修复下颌骨临界性骨缺损后，随 着时间延长，骨骼的改建最终可以达到正常的生物力学特性。
致谢：感谢四川大学华西动物实验中心的大力支持和协作。
【参考文献】
1   Kon E, Muraglia A, Corsi A, et al. Autologous bone marrow   stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic acceleratebone repair in critical-size defects of sheep long bones[J]. J BiomedMater Res, 2000, 49（3）：328-337.
2   陈钢, 赵士杰. 用于评价骨修复材料的临界性骨缺损[J]. 国外医学口腔医学分册, 2001, 28（2）：71-73. CHEN Gang, ZHAO Shi-jie. Study on bone regeneration in cri-tical bone defects[J]. Foreign Medical Sciences（Stomatology）,2001, 28（2）：71-73.  
3   李祖兵, 余世斌, 东耀峻, 等. 下颌骨缺损重建植入材料的回顾性研究[J]. 实用口腔医学杂志, 2003, 19（1）：37-39.LI Zu-bing, YU Shi-bin, DONG Yao-jun, et al. Retrospectivestudy on the materials used in the reconstruction of mandibulardefects[J]. J Pract Stomatol, 2003, 19（1）：37-39.
4   Bauer TW, Muschler GF. Bone graft materials. An overview ofthe basic science[J]. Clin Orthop Relat Res, 2000, （371）：10-27.
5   刘宝林. 肿瘤术后颌骨缺损的功能重建[J]. 中华口腔医学杂志,2003, 18（1）：9-11.LIU Bao-lin. Functional implantation reconstruction of acquiredjaw defects after tumor resection[J]. Chin J Stomatol, 2003, 18（1）：9-11.
6   Duda M, Pajak J. The issue of bioresorption of the Bio-Ossxenogeneic bone substitute in bone defects[J]. Ann Univ MariaeCurie Sklodowska Med, 2004, 59（1）：269-277.
7   Jensen SS, Yeo A, Dard M, et al. Evaluation of a novel bipha-sic calcium phosphate in standardized bone defects： A histologicand histomorphometric study in the mandibles of minipigs[J]. ClinOral Implants Res, 2007, 18（6）：752-760.
8   Oest ME, Dupont KM, Kong HJ, et al. Quantitative assessmentof scaffold and growth factor-mediated repair of critically sizedbone defects[J]. J Orthop Res, 2007, 25（7）：941-950.
9   Yoshikawa H, Myoui A. Bone tissue engineering with poroushydroxyapatite ceramics[J]. J Artif Organs, 2005, 8（3）：131-136.
10  丁真奇, 练克俭, 康两奇, 等. 脱蛋白牛松质骨复合骨髓在脊柱后外侧融合术中的应用[J]. 中国骨伤, 2001, 14（2）：69-70.DING Zhen-qi, LIAN Ke-jian, KANG Liang-qi, et al. Depro-teinized bovine cancellous composite bone graft for posterolateralspinal fusion[J]. Chin J Orthopaedics Traumatology, 2001, 14（2）：69-70.
11  Yuan H, van Blitterswijk CA, de Groot K, et al. A comparisonof bone formation in biphasic calcium phosphate（BCP） and hy-droxyapatite（HA） implanted in muscle and bone of dogs at dif-ferent time periods[J]. J Biomed Mater Res A, 2006, 78（1）：139-147.
12  孟纯阳, 安洪, 蒋电明, 等. 网孔纳米羟基磷灰石聚酰胺人工骨修复兔桡骨缺损[J]. 中华创伤杂志, 2005, 21（3）：187-191.MENG Chun-yang, AN Hong, JIANG Dian-ming, et al. Repairof bone defect with porous composite of nano-hydroxyapatite andpolyamide[J]. Chin J Trauma, 2005, 21（3）：187-191.