脐带血血浆在人巨细胞病毒垂直传播中的作用

人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus， HCMV)属疱疹病毒亚科，在人群中感染普遍，受HCMV感染的个体可终身携带病毒，并在唾液、尿液、精液、宫颈分泌物和(或)乳汁中间断地排除病毒[1]。HCMV可通过胎盘、产道及泌乳方式由母体传染给子代，目前HCMV发生垂直传播的方式和途径尚不清楚[2]。本文通过对新生儿脐带血白细胞和血浆中的HCMV基因检测研究，初步探讨脐带血血浆在HCMV垂直传播中的意义，为新生儿HCMV先天性感染的早期诊断和防治提供依据，现将结果报告如下。
1　对象与方法
1.1　研究对象
随机抽取合肥市妇幼保健院2010年11月～2011年3月的健康顺产妇女所产新生儿的脐带血为研究对象，共51份。脐带血采集方法：当胎儿娩出后立即断脐，消毒，封闭式采集脐血，至胎盘剥离停止采血，脐血收集至无菌、加有抗凝剂的三角瓶中，4 ℃保存备用。
本研究中51例新生儿均为足月产儿，体重均大于2.5 kg，新生儿的神经反射及听力测试均正常。有6例新生儿出生时羊水异常，其中4例羊水污染，2例羊水过少。
1.2　细胞株及病毒株
阳性对照的HCMV AD169株由复旦大学医学院微生物教研室提供。接种AD169株的6～8代人成纤维细胞株是按本实验室常规方法制备。
1.3　试剂来源
HCMV巢式PCR引物参照Lukacsi等[3]研究，由上海英骏生物技术有限公司合成。DNA提取试剂盒购自Solarbio公司。DNA IQ? system-small sample casework protocol试剂盒购自Promega公司。异硫氰基荧光素(FITC)标记的HCMV pp65单克隆抗体购自美国Millipore公司，HCMV IgG检测试剂盒购自意大利DIESSE公司。
1.4　方法
1.4.1　标本处理
脐带血(抗凝)：2500 r/min离心5 min，吸取血浆。剩余血细胞中加入5倍体积的红细胞裂解液，10 min后离心，弃上清，重复裂解1次，收集白细胞于200 μl生理盐水中成白细胞悬液，血浆及白细胞悬液-20 ℃保存备用。利用Solarbio公司的DNA提取试剂盒提取白细胞DNA，-20 ℃保存备用。利用Promega公司的微量DNA提取试剂盒提取血浆DNA，-20 ℃保存备用。
1.4.2　HCMV UL55基因巢式PCR
HCMV UL55基因巢式PCR外侧上游引物序列为5'-GGAAACGTGTCCGTCTTTGA-3'，其下游引物序列5'-GAGTAGCAGCGTCCTGGCGA-3';内侧上游引物序列为5'-GGAACTGGAACGTTTGGC-3'，其下游引物序列5'-GAAACGCGCGGCAATCGG-3'，最终PCR产物为285 bp。
首轮PCR反应体系25 μl：外侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及DNA模板2 μl。循环参数设置：95 ℃ 3 min，然后95 ℃变性30 s,54 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min， 35个循环后，72 ℃延伸10 min。
第二轮PCR反应容积为25 μl：内侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及首轮反应产物2 μl。循环参数设置：95 ℃ 3 min，然后95 ℃变性30 s,60 ℃ 40 s,72 ℃1 min， 35个循环后，72 ℃延伸10 min。
取扩增产物6 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳。阴性对照应无条带，阳性对照、检测标本出现符合扩增片段大小的条带可判为阳性，否则应判为阴性。
1.4.3　测序
巢式PCR扩增的产物，用PCR内侧引物作为测序引物，由上海Invitrogen贸易有限公司进行测序，并采用NCBI在线工具BLAST进行序列比对。
1.4.4　HCMV pp65抗原检测
PBS冲洗涂片2次;1%Triton100,37 ℃，10 min破膜;PBS洗涤后37 ℃避光封闭1 h;FITC标记的pp65(1∶150稀释)单克隆抗体免疫荧光染色，37 ℃孵育2 h;PBS洗涤后，DAPI 37 ℃避光染色10 min;0.1%伊文思蓝37 ℃避光复染10 min;80%甘油封片;使用荧光显微镜观察结果，蓝色为DAPI染色的胞核，红色为伊文思蓝着色的包膜结构，绿色或黄绿色荧光为FITC标记的pp65蛋白阳性信号，HCMV pp65抗原阳性细胞数≥5个/2×105单个核细胞为抗原阳性。
1.4.5　HCMV IgG 抗体检测
脐血血清HCMV IgG抗体检测，按意大利DIESSE试剂盒说明书操作。结果判定用吸光度法，以酶标光度仪检测各孔吸光度值(optical density，OD)，检测波长450nm，样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1判定为阳性。
1.5　统计分析
使用Excel 2003录入数据，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，定性资料两组间比较采用配对2检验，检验水准α=0.05。
2　结果
2.1　新生儿脐带血白细胞及血浆HCMV UL55基因巢式PCR
51份新生儿脐带血白细胞HCMV UL55基因巢式PCR检测发现，阳性数为16份，阴性数为35份，阳性率为31.4%，见图1。 51份新生儿脐带血血浆HCMV UL55基因巢式PCR检测，阳性数为17份，阴性数为34份，阳性率为33.3%，见图2。
HCMV UL55基因巢式PCR阳性标本的测序结果与巢式PCR引物设计的序列相一致。测序结果利用NCBI在线工具BLAST进行序列比对，证明为HCMV UL55基因。
2.2　51份新生儿脐带血白细胞及血浆DNA、HCMV巢式PCR结果比较
51份新生儿脐带血白细胞与血浆利用HCMV UL55基因巢式PCR检测后，注：1为DNA marker;2～10、12、16为阴性标本;11、13～15为阳性标本;17为阳性对照;18为阴性对照。　　图1　新生儿脐带血白细胞DNA HCMV巢式PCR结果　注：1为DNA marker;5、6、14、15为阳性标本;2～4、7～13、16为阴性标本;17为阳性对照;18为阴性对照。图2　新生儿脐带血血浆DNA HCMV巢式PCR结果
两者的阳性标本一致数为12份，阴性标本一致数为30份，一致数共为42份，一致率为82.4%，两者差异无统计学意义(2=0.00，P=1.000)，见表1。表1　51份新生儿脐带血白细胞及血浆HCMV巢式PCR结果比较
2.3　18份新生儿脐带血pp65抗原血症检测结果
pp65抗原血症检测病毒蛋白表达，是检测HCMV活动性感染的一个重要指标。随机选取18份新生儿脐带血白细胞利用pp65抗原血症检测，阳性标本数为6份，阳性率为33.3%。
2.4　18份新生儿脐带血白细胞pp65抗原血症检测与血浆DNA巢式PCR结果比较
上述随机选取的18份脐带血其血浆DNA巢式PCR阳性为5例，阳性率为27.8%，与pp65抗原血症结果相比较，阳性一致数为2份，阴性一致数为9份，一致数共为11份，一致率为61.1%，两种方法的检测结果间差异无统计学意义(2=0.00，P=1.000)，见表2。表2　脐带血白细胞pp65抗原血症检测与血浆DNA巢式PCR结果比较
2.5　HCMV IgG检测结果
51份新生儿脐带血血清利用意大利DIESSE的ELISA试剂盒检测HCMV IgG，得出HCMV IgG阳性标本数为48份，阳性率为94.1%。其中脐带血白细胞、血浆HCMV DNA阳性的标本及HCMV pp65抗原血症结果阳性的标本，其HCMV IgG均为阳性。
3　讨论
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，是母亲和胎儿进行物质交换的枢纽，张睿等[4]、付锦华等[5]研究认为从脐血或产后早期新生儿器官、绒毛及胚胎中检出HCMV DNA即可诊断为先天性HCMV感染。本研究中，笔者通过利用HCMV UL55基因的巢式PCR检测新生儿脐带血DNA，初步了解合肥地区新生儿HCMV先天性感染率约为31.4%。目前HCMV发生垂直传播的方式和途径尚不清楚。动物实验显示，首先胎盘感染，大量的白细胞积聚在绒毛间腔，HCMV感染的细胞内显示特征性的包涵体，紧接着病毒通过胎盘屏障到胎儿体内。另一种途径是感染的白细胞通过脐血管进入胎儿循环——血源性病毒传播。这表明在HCMV垂直传播中，白细胞在携带、传播病毒中起重要作用。Spector等[6]将HCMV DNA 阳性血浆通过0.2 μm孔径滤膜后， 取滤液接种到包皮成纤维细胞上培养，出现特征性细胞病变，证明HCMV DNA阳性血浆中存在游离的(无细胞的Cell-free) HCMV，可导致HCMV传播，这提示血浆在HCMV垂直传播中可能起携带与传播病毒的作用。本研究结果表明，脐带血白细胞和血浆中HCMV DNA的阳性率基本相似，且一致率较高(82.4%)，两者差异无统计学意义，且灵敏度及特异性都较高，这进一步证实了HCMV垂直传播中血浆可能起携带与传播病毒的作用。血管内皮细胞也是HCMV复制和增殖的场所[7]，本研究的血浆中HCMV UL55基因阳性率略高于白细胞，这可能是由于HCMV在血管内皮细胞中复制及增殖，释放入血，存在于血浆中。今后笔者将通过扩大标本量，定量检测新生儿脐带血血浆中HCMV DNA的拷贝数及蛋白表达情况来进一步研究和探讨血浆在HCMV的垂直传播中所起的携带与传播病毒的作用。
目前多形核白细胞中的HCMV-pp65抗原血症已被公认为HCMV活动性感染的重要标志。闻良珍[8]认为血浆中HCMV DNA阳性代表活动性感染，但目前尚存在争议。本研究中随机抽取其中18份新生儿脐带血白细胞利用pp65抗原血症进行检测，阳性标本数6份，阳性率为33.3%，与此18份血浆DNA巢式PCR结果相比较，阳性一致数为2份，阴性一致数为9份，一致率为61.1%，一致率较高，经检验两者差异无统计学意义。这表明，血浆中HCMV DNA的检出与HCMV活动性感染具有一定的相关性，这也进一步提示血浆在HCMV垂直传播中可能起携带病毒导致病毒传播的作用。
另外，本研究还对51份新生儿脐带血血浆进行了HCMV IgG的检测，结果表明HCMV IgG阳性标本数为48份，阳性率为94.1%。其中脐带血白细胞、血浆HCMV DNA阳性的标本及HCMV pp65抗原血症结果阳性的标本，其HCMV IgG均为阳性。但由于HCMV IgG能够穿过胎盘，由母体传播至胎儿，所以脐血中HCMV IgG检测出阳性，并不能代表新生儿先天性HCMV感染，所以在此HCMV IgG阳性的结果仅作为参考。
【参考文献】
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[3]　Lukacsi A， Tarodi B， Endreffy E. Human cytomegalovirus gB genotype 1 is dominant in congenital infections in South Hungary [J]. J Med Virol， 2001,65(3)：537-542.
[4]　张睿，刘新质. 孕妇巨细胞病毒感染及其宫内传播的探讨 [J]. 中华实用妇科与产科杂志， 1999,15(3)：166-169.
[5]　付锦华，管立学，徐大凤. 孕妇血清中人类巨细胞病毒DNA含量与胎儿宫内感染的关系 [J]. 中国优生与遗传杂志， 2004,12(4)：74-75.
[6]　Sepctor SA， Merrill R， Wolf D， et al. Detection of human cytomegalovirus in plasma of AIDS patients during a cute visceral disease by DNA amplification [J] .J Clin Microbiol， 1992,30 (9)：2359-2365.
[7]　Adler B， Sinzqer C. Endothelial cells in human cytomegalovirus infection： one host cell out of many or a crucial target for virus spread? [J]. Thromb Haemost ， 2009,102(6)：1057-1063.
[8]　闻良珍. 妇科危重病急救(一)人巨细胞病毒先天性感染的研究现状 [J]. 实用医学杂志， 2004,20(2)：109-110.