新生儿人巨细胞病毒先天性感染危险因素筛查

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是常见的β-疱疹病毒，也是孕妇宫内感染致胎儿畸形的五大病原体之一。无论是原发感染、潜伏再激活感染还是再发感染，只要孕期存在HCMV活动性感染，都可以导致HCMV的垂直传播，引起胎儿发生先天性HCMV感染[1,2]。因此，HCMV母婴垂直传播一直是国内外学者的研究热点。本研究分析了产妇年龄、孕周、Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpers simplex virus，HSV-Ⅰ)IgG阳性等因素与HCMV先天性感染的相关性，现将结果报告如下。
1　对象与方法
1.1　研究对象
收集2010年11月～2011年6月，某市妇幼保健院就诊的健康产妇所娩新生儿抗凝脐血178份，以脐带血中HCMV IgG抗体阳性同时检出HCMV gB基因为先天感染的诊断标准。所有产妇均排除其他病毒感染、弓形体感染、妊娠合并症;排除智力低下、精神障碍及家族遗传病史。
1.2　病毒株
HCMV AD169株由复旦大学医学院微生物教研室提供，本实验室保存，作为本研究中HCMV gB巢式PCR的阳性对照。
1.3　仪器试剂
HCMV gB巢式PCR引物参照Lukacsi等[3]研究，由上海英骏生物技术有限公司合成。全血DNA抽提试剂盒购自Solarbio公司;HCMV IgG 和HSV-Ⅰ IgG ELISA检测试剂盒购自意大利DIESSE公司，编号为YZB/ITA 0237-2010和YZB/ITA 0235-2010;酶标光度仪(KHB-ST)判断ELISA结果;巢式PCR采用Biometra公司梯度PCR仪;Gel Documentation System Biosens SC720凝胶成像系统观察并记录PCR结果。
1.4　方法
1.4.1　标本采集和处理
脐带血采自脐带新生儿端，无菌非抗凝管收集3 ml，肝素抗凝管收集3 ml。冰盒运送至实验室检测，所有标本均在采集后6 h内处理。非抗凝脐带血自然析出血清后，取上清，1∶1加无菌甘油，混匀后-80 °C保存备检;抗凝血使用全血DNA抽提试剂盒提取DNA，按试剂盒说明书操作，-20 °C保存备检。
1.4.2　HCMV、HSV-Ⅰ IgG 抗体检测
脐带血血清HCMV IgG和HSV-Ⅰ IgG 抗体检测，按试剂盒说明书操作。结果判定用吸光度法，检测波长450 nm，以酶标光度仪检测各孔吸光度值(optical density，OD)判断，样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1判定为阳性。
1.4.3　HCMV gB巢式PCR
以脐带血全血DNA为模板进行检测。外侧上游引物序列为5'-GGAAACGTGTCCGTCTTTGA-3'，其下游引物序列为5'-GAGTAGCAGCGTCCTGGCGA-3';内侧上游引物序列为5'-GGAACTGGAACGTTTGGC-3'，其下游引物序列为5'-GAAACGCGCGGCAATCGG-3'，最终PCR产物为285 bp。
首轮PCR反应容积为25 μl：外侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及DNA模板2 μl。循环参数为：95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,54℃ 40 s，72℃ 1 min， 35个循环后，72 ℃延伸10 min。
第二轮PCR反应容积为25 μl：内侧引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、MgCl2 0.75 μl、10×Buffer 2.5 μl、无菌水18 μl以及首轮反应产物2 μl。循环参数为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min， 35个循环后，72 ℃延伸10 min。
1.5　统计分析
运用Excel 2003录入数据，使用SPSS 17.0 进行统计分析，计数资料采用.2检验，检验水准α=0.05。
2　结果
2.1　HCMV、HSV-Ⅰ IgG、HCMV gB DNA检测结果
检测178份脐带血HCMV IgG和HSV-Ⅰ IgG抗体，其中HCMV IgG阳性177例，阳性率为99.44%;HSV-Ⅰ阳性149例，阳性率为83.71%。脐带血HCMV gB巢式PCR扩增的产物，均用PCR内侧引物作为测序引物，由上海英骏生物技术有限公司进行测序，并用NCBI在线工具BLAST进行序列比对，结果均为HCMV gB基因序列，阳性57例，阴性121例，先天性感染率为32.02%(57/178)，见图1。注：1：DNA marker;2：HCMV阳性对照;3：阴性对照;4：阳性标本;5：HCMV阴性标本。图1　新生儿脐血HCMV gB巢式PCR结果
2.2　产妇HSV-Ⅰ感染与新生儿HCMV先天性感染
按产妇HSV-Ⅰ感染情况分组，经检验两组新生儿HCMV先天性感染率差异无统计学意义(.2=1.03， P=0.310)，提示产妇HSV-Ⅰ IgG抗体阳性不是引起新生儿HCMV先天性感染的危险因素，见表1。表1　HSV-Ⅰ IgG与HCMV gB DNA阳性结果比较
2.3　产妇年龄与新生儿HCMV先天性感染
按产妇年龄将178例新生儿分组，随着产妇年龄的增加，新生儿HCMV感染率有上升趋势，但差异无统计学意义(均有P>0.05)，见表2。
2.4　早产和过期产与新生儿HCMV先天性感染
按产妇孕周将178例新生儿分为3组：不足37周(早产),37～42周(足月产)，超过42周(过期产)。经.2检验，3组HCMV gB阳性率差异有统计学意义(.2=3.93，P=0.048)。再分别两两比较，早产与足月产两组新生儿HCMV gB阳性率差异有统计学意义(.2=5.35，P=0.021);过期产与足月产两组新生儿HCMV gB阳性率差异有统计学意义(.2=8.04，P=0.005)，见表3。表2　产妇年龄与新生儿HCMV先天性感染表3　产妇孕周与新生儿HCMV先天性感染
3　讨论
HCMV是最常见的母婴垂直传播感染的病原体，Lazzarotto等[4]认为这主要有两个原因：首先，育龄妇女HCMV感染非常普遍;其次HCMV会导致孕妇原发感染或再发感染(包括激活感染和再感染)，在发达国家原发感染常见，而再发感染在发展中国家很多见，两者都可以导致HCMV的垂直传播。
病毒分离实验一直是诊断HCMV感染的金标准，但由于检测周期长，费时费力，现临床已经很少采用。编码gB糖蛋白的UL55基因高度保守，巢式PCR扩增UL55的核酸序列，其敏感性和特异性均高于病毒培养法，且不与其他病毒及正常人基因发生交叉反应[5]。因此，本研究以脐血中HCMV IgG抗体阳性同时检出HCMV gB基因为先天性感染诊断标准。研究结果显示，产妇HCMV 感染率为99.44%，与闻良珍等[6]报道武汉、沈阳、上海地区孕妇HCMV 感染率相一致;发生垂直传播导致新生儿先天性感染的几率为32.02%，远高于Stagno等[7]的报道。产妇的年龄与新生儿HCMV感染率没有相关性，不是新生儿HCMV先天性感染的危险因素。
发生新生儿HCMV先天性感染的因素包括孕妇的经济水平、文化程度、职业和怀孕次数等[8]。本研究显示，产妇HSV-Ⅰ IgG阳性不是引起新生儿HCMV先天性感染的危险因素。
此外，Yinon等[9]研究发现，10%～15%的先天性HCMV感染婴儿在出生时伴有宫内生长受限、小头畸形、肝脾肿大、瘀斑、黄疸和脉络膜视网膜炎症状，死亡率约为20%～30%。大部分先天性感染婴儿在出生时没有症状，但是他们当中约有5%～15%会出现感音神经性听觉丧失、神经发育迟缓以及视觉损伤。本次研究的178例新生儿中，均未发现上述症状。早产儿中HCMV先天性感染率为60.00%，足月儿为29.61%，过期产儿为27.27%,3组感染率差异有统计学意义。两两比较显示，早产及过期产与新生儿HCMV先天性感染有关。因此，对于早产儿和过期产儿，应该加强其HCMV先天性感染的早期诊断。
本研究标本数量有限，今后需要进一步增加样本数量，扩大采集地区范围。研究孕妇和新生儿HCMV感染情况，对制定保障孕妇和新生儿健康以及开展优生优育、提高人口素质的方针政策有重要指导意义。
【参考文献】
[1]　Syggelou A， Iacovidou N， Kloudas S， et al. Congenital cytomegalovirus infection [J]. Ann N Y Acad Sci， 2010,1205：144-147.
[2]　Nigro G， Adler SP. Cytomegalovirus infections during pregnancy. [J]. Curr Opin Obstet Gynecol， 2011,23(2)：123-128.
[3]　Lukácsi A， Taródi B， Endreffy E， et al. Human cytomegalovirus gB genotype 1 is dominant in congenital infections in South Hungary [J]. J Med Virol， 2001,65(3)：537-542.
[4]　Lazzarotto T， Lanari M. Why is cytomegalovirus the most frequent cause of congenital infection? [J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2011,9(10)：841-843.
[5]　Elliott SP. Congenital cytomegalovirus infection： an overview [J]. Infect Disord Drug Targets， 2011,11(5)：432-436.
[6]　闻良珍，吴圣楣，吕绳敏，等. 三城市孕妇人巨细胞病毒感染及母儿传播的研究 [J]. 中华妇产科杂志， 1996,31(12)：714-717.
[7]　Stagno S， Pass RF， Cloud G， et al. Primary cytomegalovirus infection in pregnancy. Incidence， transmission to fetus， and clinical outcome [J]. JAMA， 1986,256(14)：1904-1908.
[8]　刘佩莉，陆嘉良，江峰. 292名孕妇人巨细胞病毒感染危险因素研究 [J]. 中华流行病学杂志， 1994,15(2)：83-86.
[9]　Yinon Y， Farine D， Yudin MH， et al. Cytomegaloviru infections in pregnancy[J]. J Obstet Gynaecol Can， 2010,32(4)：355-362.