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发表时间：2014-06-12 浏览次数：445次
机械通气时，应力损伤会引起细胞膜结构的改变并引发与之相关的信号传递链的变化，最终引发炎症因子的广泛释放和肺部病变，而细胞膜小窝及小窝蛋白一1(cav-1)在应力损伤的调控方面起着十分关键的作用。本研究中试图利用应力损伤模型，研究cav-1在不同潮气量(VT)通气条件下的表达及其信号转导机制，为肺损伤的防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1主要试剂:髓过氧化物酶(MPO)测试盒(南京建成生物工程研究所)，大鼠肿瘤坏死因子一。(TNF-创酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京达科为生物科技公司)，白细胞介素一1受体相关激酶4(IRAK4)多克隆抗体(多抗，英国Biorbvt公司)，cav-1多抗(美国Santa公司)，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、核转录因子一KB(N'F-KB)p65多抗(北京博奥森生物科技有限公司)。
1.2实验动物分组及模型建立:40只健康成年雄性SD大鼠，体质量200一340 g，由桂林医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK桂)2007-0001按照随机数字表法将动物分为5组，每组8只对照组(A组):仅行气管切开;保护性通气1h和2h组(B1和B2组):V为6 ml/kg，呼气末正压(PEEP)为5 cm H}0(1 cm H}0=0.098 kPa)，呼吸频率(RR)为h0次/min，通气时间分别为1h和2 h}";大叭通气1h和2h组(C1和C2组):}'.!为30 ml/kg, PEEL'为0,RR为40次/min，通气时间分别为1h和2h各组大鼠吸呼比(I : E)1 : 2，吸人气体为室内空气。实验前12h禁食，自由饮水。腹腔注射20%鸟拉坦5 mg/kg麻醉，颈部正中切开气管并置人气管导管，连接AVea全功能呼吸机(美国V% I ASYS公司)。A组在气管切开即刻、其余组在机械通气后放血处死大鼠，采集标本备检二本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。
1.3检测指标及方法
1.3.1支气管肺泡灌洗液(BALF )中Tl} F-。浓度测定:处死大鼠后完整取出肺脏，气管分叉处结扎右主支气管，左肺给予冰生理盐水灌洗(2.5 ml x 3次)，回收B ALF，低温离心取上清液，EL1SA检测BALE中TaF-。浓度，操作按试剂盒说明书进行。
1.3.2肺湿/干质量比值(Uw /D)测定:取右肺中叶，分别称量湿质量和干质量，计算}} /D比值。
1.3.3肺组织'VIPO活性测定:取右肺副叶，加人匀浆介质制作组织匀浆用比色法测定MPO活性，操作按试剂盒说明书进行。
1.3.4肺组织病理学观察及cav-1,eNOS,IRAI}4,NF-KBp65免疫组化观察:取大鼠右肺前叶，用lOGlc中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、苏木素一伊红(HIJ)染色，光镜下观察病理切片。采用免疫组化法测定大鼠肺组织(cav-1,eNOS ,IRAK4及NF-KBp6_5的蛋自表达，在光镜下观测棕黄色颗粒为阳性产物，每个标本随机选取5个不重叠的视野，用病理图像分析系统测定免疫组化反应阳性颗粒的平均吸光度(A)值，计算_5个视野<9.值均值，进行半定量分析。
1.3.5逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肺组织cav-1,eNOS的mRNA表达:取100 mg右肺下叶，提取肺组织总RNA。 cav-1,eNOS引物序列由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。引物序列:cav-1上游5'-G ATTGCGGAACCAGAAGG-3'，下游5'-CCAT_4GGGATGCCGAAG AT-3'，扩增产物大小122饰;eNOS上游5'-CGACATTG AGATC AAAGGACTG-3'，下游5'-ACTTGTCCAAACACTCCACGC-3' ,扩增产物大小129 by。以阶肌动蛋自((3-actin)为内参照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用全自动数码凝胶成像分析系统摄像，SensiAnsvs凝胶图像分析系统分析，以目的基因与内参照基因在凝胶图像上的A值比值作为基因表达的相对含量。
1.4统计学分析:实验数据以均数士标准差表示，应用SPSS 17.0统计学软件进行单因素方差分析和S} K-q检验，P< 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠肺组织病理学观察:A组肺组织正常，未见组织学损伤改变;Bl,B2组肺泡结构完整，有少量炎性细胞浸润，肺泡间隔无水肿，肺泡腔无明显渗出物;C1组肺泡间隔增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，部分肺泡腔内有血性渗出液;C2组肺泡间隔增厚，浸润的炎性细胞明显增多，肺泡腔可见较多的渗出物，部分肺泡萎陷或破裂。
2.2各组肺组织}' /D比值、MPO活性及BALE中TNF-。浓度(表1): A, B1, B2组间肺W/D比值、NIPO活性及TN F-。浓度比较差异均无统计学意义(均P> 0.05)。C1组各指标较B1组显著增高，C2组各指标较B2组、C1组显著增高(均P< 0.05 ) 。
2.3各组肺组织cav-1,eNOS的mRNA表达(图1;表2):A,B1,B2组间cav-l ,eNOS的mRN A表达比较差异均无统计学意义(均P> 0.05)。C1组cav-1mRNA表达较B1组显著上调，eNOS mRNA表达较B1组显著下调(均P< 0.05)。C2组cav-1 mRNA表达较B2组、Cl组显著上调，eNOS mRN A表达较B2组、C1组显著下调(均P< 0.05)。
2.4各组肺组织cav-1, eNOS, IRAK4, NF-KBp65
的蛋白表达:表2结果显示，A,B1,B2组间。av-1 ,eNOS , IRAK4 , NF-KBp65的蛋白表达比较差异均无统计学意义(均P>0.05)} Cl组cav-1, IRAK4 ,NF-KBp65的蛋白表达均较B1组增强，eNOS蛋白表达则较BI组减少(均P<0.05)} C2组cav-1 ,RAK4,NF-KBp65的蛋白表达均较B2组、C1组增强，eN OS蛋白表达较B2组、Cl组均减少(均P<0.05)图2结果显示，A,B1,B2组肺组织中cav-1,IR AK4 , N F-KBp65均呈弱表达，eNOS呈强表达;随着丫:加大、通气时间的延长，支气管和肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和浸润的炎性细胞上cav-1 ,IRAK4 , NF-KBp65表达增强，eNOS表达减弱。
3讨论
危重患者常并发呼吸机相关性肺损伤(VILI ) .临床上主要是通过改变通气策略与模式来减少其的发生VILI的病理生理基础是肺对变形应力反应，应力损伤会引起膜结构的改变并引发与之相关的信号传递链变化，最终引发炎症因子的广泛释放和肺部病变“7。而近年来研究发现，位于细胞膜上的小窝及构成小窝的。av-1在应力损伤调控方面起关键作用"- cav-1是小窝的主要结构蛋白，包括I型上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，在肺的各种细胞都存在，除诱导小窝合成外，在介导炎症信号通路方面也起关键作用。
Mirza等〔H}证实，cav-1在基础状态与eNOS呈结合状态并抑制eNOS的活性。cav-1基因敲除小鼠(cav-I-/-)在受到脂多糖(LPS)损伤时，肺损伤程度及死亡率均较野生型小鼠低，这是因为eNOS失去了cav-I的调节，通过酪氨酸硝化作用导致IRAK4活性受损，从而降低了NF-KB的活性，减缓了由接头蛋白髓样分化蛋白(MyD88 )-IRAK4通路调节的Toll样受体4(TLR4)信号链的传递，并最终降低了炎症损伤。本研究中通过建立不同V:和通气时间的大鼠通气模型，模拟临床上机械通气诱发肺损伤的过程，探讨cav-1,eNOS,IRAK4,NF-KB相关信号链在通气过程中表达的变化及其对肺损伤的影响。结果表明，大v:机械通气较保护性机械通气大鼠出现明显的肺组织病理学损伤，且MPO , W/D比值、蛋白定量及BALF中TNF-。含量均升高，提示机械通气大鼠模型复制成功。
本实验中RT-PCR及免疫组化结果表明，大jig.通气组cav-1,IRAK4,NF-KB的表达均较保护性通气组及对照组随着通气时间延长而增强，而NOS则相反，与Mirza等〔s〕的实验结果相似。可能cav-1与eNOS的结合促进了TLRs介导的VILI发生。众所周知，TLRs在最开始的肺损伤研究中被认为是特异性识别病原相关分子模式，是“瀑布样”炎症反应的闸门，其与炎症反应及多器官功能障碍的发有着密切联系‘y}。目前的研究认为，TLR、还会把受损组织释放的内源性配体当作危险信号。VanekPr等”。〕发现，机械通气后小鼠BALF中TLR4相关的内源性配体高迁移率族蛋白、透明质烷、热体克蛋自等都增加，这些内源性配体可激活TLR4，并启动TLR介导的炎症反应〔u-u7Gurlev等}a〕认为机械通气引起的肺损伤使受损组织释放的内源性配体高迁移率族蛋白、透明质烷等激活TLR4,TLR4被激活后通过其TIR区与被招募的MvD88绑定，然后去激活MvD88依赖或MvD88非依赖通路MvD88招募丝氨酸一苏氨酸激酶IRAK4和IRAi}l, IRAI}4磷酸化1R AK1导致招募肿瘤坏死因子受体相关因子6('I'RAF6)受体复合物，并激活转化生长因子p激活激酶(TAK1 ), 1}4I}1的激活导致NF-KB的激活，NF-KB可以导致一系列如TN F-a、氧化还原酶趋化抑制因子一la (MIP-la)、细胞间钻附分子一1( ICAM-1 )等促炎因子、趋化因子以及劲附分子的产生15-16，本研究中大VT通气组BALF中TNF-。显著增高，与上述理论一致。
本研究借助大Y:机械通气的应力损伤使内源性配体释放，激活TLRs通路，随着通气时I可延长，ca、一1表达越强，e110S表达越弱，肺损伤越严重，表明在大叭机械通气中，因为、}av-1对eNOS的抑制增加，使IR AK4的硝化减弱，从而使其活性增加，并激活11}F'-KB , T1}F-a等炎症因子，造成肺损伤HoetzPl等nl证实，机械通气可致〔eav-I-/_小鼠出现更加严重的肺损伤，吸人一氧化碳( CO)对野生型机械通气小鼠有明显的保护作用，但CO吸入对cav-1-/-小鼠肺无保护作用;木实验显示，oav-I在机械通气过程中有保护作用，但从。}aS--I ,Eros,IRAK4 ,1}F-KB介质介导的相关信号链的研究来看，cav-1促进了机械通气过程中肺损伤的发生。
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