脂多糖诱导气道上皮细胞过氧化物氧化还原酶1的表达

过氧化物氧化还原酶1(prdxl)作为过氧化物酶对维持体内过氧化氢( H}O})水平发挥着重要的作用，并且通过调控蛋白激酶的氧化还原状态参与细胞信号转导的调控过程〔11。但是prdxl在肺损伤炎症过程中的作用和信号转导途径仍不清楚。有研究表明，prdx家族蛋白的表达与肺部炎症疾病有关，但在不同细胞不同因素作用下prdxl的表达亦不同’本研究中以正常人气道上皮细胞株BEAS-2B为研究对象，观察脂多糖(LPS)作用于气道上皮细胞后

prdxl的表达变化，以期阐明prdxl基因在气道上皮细胞内的可诱导表达及在炎症反应中的作用。

1材料和方法

1.1主要实验材料:BEAS-2B细胞株〔由美国模式培养物集存库(ATCC)提供〕;铜绿假单胞菌LPS,过硫酸钱、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酞胺、四甲基二乙胺、N,N’一甲叉双丙烯酚胺(Sigma公司，美国);放射免疫沉淀分析裂解液(RIPA裂解液)、无水乙醇、脱脂奶粉(广州威佳公司);二辛可酸(BCA)、蛋自定量试剂盒(Therm。公司，美国)，p一肌动蛋白((3 -actin)抗体(Santa crn:公司，美国);抗prdxl多克隆抗体(Abcam公司，美国)，辣根过氧化物酶标记

的羊抗兔IgG} .Tackson公司。美国)。

1.2细胞培养方法:将正常人的气道上皮细胞株BEAS-2B培养于含10%胎牛血清的DMEM/E12培养基中，置于37 0C ,5%CO:恒温培养箱中。当细胞融合度为80%左右时用胰酶消化传代。收集培养的细胞计数后分别铺板于培养皿或6孔培养板中，待细胞贴壁12h后再分别加人相同体积但不同浓度的LPS作用于气道上皮细胞，对照组加人同体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。分别于作用12h和24 h时收集细胞，用于提取细胞RNA和蛋白。

1.3逆转录一聚合酶链反应(RT-PC R)检测prdx 1mRNA的表达:使用TRIzoI试剂提取细胞总RNA,测定RNA浓度后取1 },g RNA逆转录为〔、DNA。取1闪逆转录产物进行PCR反应，反应体系为20闪，PCR步骤为95 0C初始化15 min,94℃变性1 min,55 0C 1 min, 72℃1 min,30一35个循环;72℃10 min,Primer 5.0设计引物(引物序列由英骏公司合成):prdxl正义链5'-GGAGGATTGGGACCCATGAA-3' ,反义链5'-AGAGCGGCCACAGG_4AG ATC-3';三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)正义链.5'-"I'CCTCCACCTTTGACGCT-3'，反义链5'-1'CTTCCTCTTGT CCT(:TTGC-3'- PCR产物经27}琼脂糖凝胶电泳，伊文思蓝(EB)染色后经成像系统拍照，用Image J软件分析各组灰度值后进行统计比较。

1.4蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测prdxl蛋白表达:BCA蛋白样品定量，40 p,g总蛋白上样，经12% SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(PAGE ) ,根据目的蛋白分子质量大小调整转膜时间，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭液封闭膜1h，抗prxl抗体(1:2000 ) 4 0C孵育过夜;漂洗3次后用辣根过氧化物酶标一记的兔抗IgG(1:20 000)在室温下孵育1h，内参照蛋白选择(3-actin ;漂洗后加人发光液曝光，显影、定影胶片。最后用Image J软件分析内参照及目的条带的灰度值比值。

1.5统计学处理:计量资料以均数土标准差(X士、)表示，用SPSS 13.0统计软件对数据进行方差分析和t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1  RT-PCR检测铜绿假单胞菌LPS对气道上皮细胞prdxl mRNA表达的影响(图1;表1):1PS作用于细胞12h内，prdxl mR1}A表达随着LPS作用剂量的增加逐渐增高;但随着LPS作用时间的延长，24 h时prdxl mRNA表达有所回落。10 mall LPS作用12h组prdxl mRNA表达量达峰值，并显著高于对照组(P< 0.05)。

2.2  }'v'estPrn blotting检测铜绿假单胞菌LPS对气道上皮细胞prdxl蛋白表达的影响(图2;表2):随着LPS剂量的增加，prdxl蛋白表达也逐渐增高，5 m到L LPS作用12h时prdxl蛋白表达量达到峰值,10 mg/L LPS作用12h时prdxl蛋白表达量仍在高位水平(均P< 0.05 )

3讨论

细菌内毒素是革兰阴性菌的主要致病因素，是许多炎症因子的有效激活物，也是引起严重脓毒症的主要介导物，它能介导多种免疫细胞(单核/巨噬细胞、库普弗细胞等)、炎症介质的释放，引发机体免疫、炎症反应。内毒素的主要成分LPS与内毒素受体相互作用，激活促炎细胞因子，从而介导细胞毒反应「31，引起急性肺损伤(ALI )、急性呼吸窘迫综合征( ARDS )，严重时可导致脓毒性休克，甚至多器官功能障碍综合征(MODS )。

正常组织的抗氧化防御系统能够有效避免过度的氧化损伤，包括各种抗氧化酶类如还原型谷肤甘肤(csH>、超氧化物歧化酶、抗坏血酸等。病理过程中氧化还原代谢反应失衡，可以产生大量的活性氧(R0引、活性氮、氧自由基、蛋白酶以及炎症介质，受到内毒素刺激损伤的肺内产生过氧化物水平增加，加剧肺局部抗氧化水平失衡，导致毛细血管的通透性增加，影响肺表面活性物质的代谢和功能，加重了肺损伤程度。

    过氧化物中的H}0:可以迅速转化成有剧毒的ROS，如经基自由基的H20}，可能会产生氧化应激，启动细胞内的抗氧化机制。氧化应激可能会损坏大多数细胞成分，引起DNA链断裂、蛋白质交联和脂质过氧化。感染或其他刺激作用于炎性细胞后激活了还原型辅酶II (NADPH)氧化酶，产生ROS，同时释放多种细胞因子和趋化因子一7一二虽然致病源可被巨噬细胞吞噬，但ROS也在不断氧化破坏各种细胞内的基质，恶化细胞外环境，造成组织炎症损伤。此外，ROS尤其是Hz0:可发挥第二信使的功能，扩散促炎和生长刺激信号+-} H}0:作为常见的信号转导分子，可激活炎性细胞内核转录因子一KB(NF-KB)后维持炎症状态，并进一步操控炎症反应〔9I。巨噬细胞、淋巴细胞以及聚集的中性粒细胞所释放的炎症

因子可进一步损伤肺组织，主要的靶细胞就是肺部上皮细胞。

在前期动物实验研究中，通过蛋自质组学技术发现，用铜绿假单胞菌LPS刺激可引起大鼠ALI中prdxl表达水平上调;通过肺泡灌洗液的酶联免疫吸附试验( ELISA)检测、免疫组化切片观察、肺组织的基因和蛋白检测均验证了这一点，且发现prdxl的表达上调存在于小气道上皮细胞〔12]

Prdxl属于双半胧氨酸型prdx ( 2-Cvs，分布在细胞质和细胞核内;N一末端有保守的半胧氨酸(Cvs)，分别位于51位和172位3二Prdx N一末端的Cyss,通过依赖硫氧还蛋白的氧化反应生成半胧次磺酸，与Cvs"_通过分子间二硫键连接，形成头尾相连的同源二聚体。这种氧化形式的prdxl依赖硫氧还蛋白还原‘“〕。Prdxl的主要生理功能是调节细胞内的H,n:水平，而H20:可作为第二信使参与细胞表面受体的信号转导，说明prdxl通过调节H-OZ参与了生长因子的信号调节途径。但prdxl在氧化应激反应中催化活性基团Cvs易被过氧化从而失去过氧化物酶活性。这种失活效应引起的变构效应使prdxl的功能转变为分子伴侣〔u，同样对细胞功能有着广泛的影响。

Prdxl作为分子伴倡的生物学功能，能通过与其他蛋白相互作用形成复合体，起到调节其他蛋自的功能如随着H}OZ浓度的逐渐升高，prdxl与c}-Jun氨基末端激酶(J}'K),磷酸化形式的磷酸酶基因( PTEN ) ,y听形成的复合物数量逐渐减少从而导致JvK活化、磷酸化形式PTE\夫活I}P}作用于巨噬细胞弓}起prdvl表达上调也是通过JvK通路起作用的19蛋日激酶B ( AKT)是PTE下游主要的信号蛋白，也是磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT细胞信号的中心枢纽，非常广泛地参与多种下游信号途径.而且与上皮细胞损伤修复相关的细胞增殖(细抱周期)、细胞凋亡等信号转导密切相关。由此可见，prdxl通过对PTE'V调节，调控AKT通路，影响细胞周期进而影响细胞增长，    

为进一步验证这一观点，本研究中采用气道上皮细胞株BE AS-2B作为研究对象，使用革牛阴性菌的主要致病成分LPS诱发炎症反应，观察LPS刺激后BEAS-2B细胞中prdxl的表达变化结果发现，5 mg/L和10 mg/I浓度下LPS作用于SEAS-2B细胞12h，均可引起prdxl表达的明显增加，经反复多次实验发现，10m到L LPS作用12h后，pxdxl蛋白高表达更加稳定推测LPS可能通过引发氧化应激反应，增加细胞内过氧化物水平表达，导致prdxl表达反应性上调。

国外有研究证明，LPS可以引起巨噬细胞产生prdxl增加〔19]，但关于LPS刺激气道上皮细胞引起prdxl表达上调还未见报道。一般认为，免疫细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞以及T,B淋巴细胞)在aLI中发挥了调节作用，但气道上皮细胞在ALI的炎症损伤修复过程中也有重要功能。以prdxl在气道上皮细胞中的功能和作用为研究切人点可对LPS的病理作用提供新的实验依据。本实验结果证明了prdxl在气道上皮内可被LPS诱导高表达，但具体的表达分子机制和信号通路仍需进一步研究。

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