补体因子H与ARMS2基因多态性与年龄相关性黄斑变性的关联研究

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration， AMD)是一种以进行性视网膜黄斑区损伤导致中心视力损害的眼底疾病，受遗传和多种环境因素共同作用。国外大量研究表明补体因子H(complement factor H，CFH)基因与10号染色体上的年龄相关性黄斑变性易感基因2(age-related maculopathy susceptibility 2，ARMS2)是AMD的易感基因，并有研究发现吸烟能增加这两个基因的效应[1]，但国内这方面的大样本综合性研究还相对较少。本研究的目的是在中国人群中验证CFH Y402H(rs1061170)与ARMS2 A69S(rs10490924)两个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)位点与AMD的关联，并分析两个SNP位点与环境因素对疾病的交互作用，为AMD的早期预防提供科学依据。
1　对象与方法
1.1　研究对象
于2008年1月～2010年5月，在全国有地域代表性的12个大城市(北京、上海、广州、西安、青岛、武汉、长沙、温州、南京、成都、沈阳和哈尔滨)的16家三级甲等医院开展调查，每个医院均选取一定数量的AMD病例及对照，进行多中心的病例对照研究。样本量计算：采用Quanto 1.2.4软件，选择单基因加性遗传模型，基因效应为1.60，人群患病率为5%，Ⅰ类错误概率为0.05，Ⅱ类错误概率为0.2，rs1061170和rs10490924的等位基因频率分别为0.067和0.477，因此将等位基因频率参数设为0.067，计算得病例和对照各需479人，考虑到基因型鉴定的成功率以及交互作用分析，样本量设为病例和对照各500人。
病例的入选标准：①年龄≥50岁;②通过荧光素血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)或光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)确诊为AMD;③无其他视网膜疾病;④签署知情同意书。排除标准：①高度近视≥6.00D;②脉络膜息肉样血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV);③黄斑营养障碍症;④中心性浆液性视网膜脉络膜病变;⑤各种类型静脉阻塞;⑥糖尿病视网膜病变;⑦色素膜炎;⑧其他影响视网膜感光细胞功能的疾患。对照的入选标准：①年龄≥50岁且与病例组年龄相差不超过5岁;②通过眼底检查排除AMD;③同意参加本研究并签署知情同意书。排除标准：身体有重大缺陷或严重慢性病、不能配合问卷及抽血检测者。
1.2　调查方法
人口学特征和临床资料：由北京大学人民医院及流行病与卫生统计学系的项目负责人按照统一的标准和要求对各中心选定的临床医生进行培训。各中心使用统一的调查表对研究对象开展问卷调查、体格检查和眼科检查。问卷内容包括一般人口学资料(年龄、性别、职业)和行为因素(吸烟和饮酒)等，吸烟是指每天吸烟1支以上且连续1个月以上[2]，饮酒是指每周饮酒至少1次并持续1年以上[3]。体格检查的内容包括血压、身高、体重和腰围。眼科检查用于确认AMD病例及对照。研究对象的纳入均由临床眼科主任医师做出诊断，再由北京大学人民医院眼科读片中心专家进行审核确认。AMD的分级参照年龄相关性眼病研究(age-related eye disease study，AREDS)的分级标准[4]：早期AMD是出现玻璃膜疣，有色素异常或无，无晚期AMD的迹象;晚期AMD包括地图样萎缩型AMD和新生血管型AMD，萎缩型是由于视网膜色素上皮脱色素和脉络膜血管暴露呈现地图性萎缩状，无新生血管型AMD的迹象;新生血管型是出现脉络膜新生血管，视网膜感觉上皮脱离，色素上皮浆液性或出血性脱离，视网膜或色素上皮下纤维化，瘢痕形成。
基因型鉴定：采集研究对象外周静脉血，使用北京天根生物技术公司生产的DNA提取试剂盒(DP319-01)进行DNA提取。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)使用ABI GeneAmp 9700384体系，基因型鉴定由毅新兴业(北京)科技有限公司采用Sequenom MassARRAY仪器进行SNP的检测。
1.3　统计分析
使用Epi Data 3.1软件建数据库，进行平行双录入。用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料的组间比较采用t检验，无序分类资料的组间比较采用2检验，多因素分析采用非条件Logistic回归，检验水准α=0.05。相乘交互作用的分析采用Logistic回归，相加交互作用分析采用交互作用超额危险度(relative excess risk of interaction，RERI)、交互作用归因比(attributable proportion of interaction，API)和交互作用指数S(interaction index S，Index S)3个指标，当RERI与API不为0，而Index S不为1时说明存在交互作用[5]。
2　结果
2.1　一般情况
共纳入AMD病例545人，对照480人，本次研究仅对成功鉴定基因型的对象(病例535人，对照469人)进行分析。535例病例中，早期患者64人(12.0%)，进展期患者471人(88.0%)，进展期患者中萎缩型7人(1.5%)，新生血管型464人(98.5%)。
2.2　AMD病例组和对照组一般特征和部分环境因素比较
病例组和对照组的平均年龄分别为(68.00±8.66)岁和(64.86±9.28)岁，两组年龄差异有统计学意义(t=5.54，P<0.001);病例组中男性324人(60.6%)，女性211人(39.4%)，对照组中男性217人(46.3%)，女性252人(53.7%);文化程度、是否做过电焊工作和体质指数(body mass index，BMI)的分布在病例组和对照组中的差异无统计学意义(均有P>0.05);病例组中有吸烟史和饮酒史的比例高于对照组，有吸烟史者患AMD的风险是无吸烟史的1.906倍，有饮酒史患AMD的风险是无饮酒史的1.516倍，见表1。　表1　病例组和对照组一般特征和环境因素分布
2.3　AMD病例组和对照组CFH Y402H和ARMS2 A69S两个位点的分布比较
Y402H多态性位点TC和CC基因型在病例组的比例高于对照组;A69S多态性位点TT基因型在病例组的比例高于对照组。携带Y402H TC和CC基因型者患AMD的风险分别是携带TT基因型者的1.835和9.092倍，携带A69S GT和TT基因型者患AMD的风险分别是携带GG基因型者的1.584和4.639倍，见表2。　表2　病例组和对照组Y402H和A69S分布
2.4　AMD危险因素的多因素分析
为进一步分析AMD的危险因素，将年龄、性别、吸烟、饮酒、Y402H和A69S基因型作为自变量，以是否患AMD作为因变量(1=患病，0=未患病)，采用逐步后退法进行非条件Logistic回归，主要变量赋值见表3。结果显示，年龄、吸烟、Y402H和A69S与AMD有统计学关联，见表4。表3　非条件Logistic回归分析变量赋值表表4　 AMD危险因素的非条件Logistic回归分析
2.5　基因-环境交互作用分析
多因素分析结果表明，吸烟、Y402H和A69S基因型对AMD患病有独立效应，应用相乘模型分别计算其与AMD是否存在交互作用，结果显示，Y402H与吸烟(P=0.820)、A69S与吸烟(P=0.678)以及Y402H与A69S(P=0.673)，其交互项均无统计学意义。同时，试在分层分析的基础上应用相加模型分析其交互作用，分别计算吸烟-Y402H与吸烟-A69S的交互作用RERI、API和Index S，Y402H基因型将TC和CC基因型合并，分为不携带C与携带C(危险基因型)两类，A69S基因型将GT和TT基因型合并，分为不携带T与携带T(危险基因型)两类。调整年龄、性别和饮酒后，吸烟与Y402H的RERI、API、Index S分别为0.919、28.210%、2.433，说明两者之间存在正交互作用，见表5;调整年龄、性别和饮酒后，吸烟与A69S的RERI、API、Index S分别为0.869、24.483%、2.108，见表6，说明两者之间存在正交互作用。　表5　吸烟与Y402H基因型交互作用分析　表6　吸烟与A69S基因型交互作用分析
3　讨论
AMD目前已成为发达国家50岁以上人群的主要致盲原因[6,7]，在美国已有800多万人因此病受累[8]。不同地区的调查表明我国AMD的患病率为3.00%～15.5%[9-12]。随着人口老龄化程度的发展，AMD患病率在逐年升高，将会影响人们尤其是老年人的生活质量，加重社会经济负担。目前AMD的有效治疗方式有限，本研究在全国范围内开展多中心的病例对照研究，研究AMD的易感基因和相关的危险因素，以及基因和环境之间的交互作用，对于高危个体的早期预防有重要的意义。
本研究发现CFH Y402H多态性位点与AMD相关，但其突变率较低，不同于既往在高加索人群中的研究。2005年3个研究小组分别证实了北美人群中CFH基因与AMD的关系，Klein等[13]采用全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)发现CFH基因内含子区有与AMD强关联的SNP，后测序发现与之连锁不平衡的SNP可引起酪氨酸到组氨酸的改变，该突变位于肝素和C反应蛋白(C-reative protein，CRP)的结合点，CRP是经典补体途径的活化因子。动物实验表明，Y402H改变会引起CFH的结合价改变，从而导致异常的补体激活[14]，补体的异常激活是AMD的病理过程之一，另外两个研究报道了类似的结果 [15,16]。同时，一些研究显示CFH基因与吸烟、饮食和肥胖等因素存在交互作用[1,17,18]，本研究也发现了CFH Y402H基因与吸烟的交互作用。Y402H基因位点的频率在不同人群中存在差异，高加索人群为45%，日本人群为4%[19]，中国香港人群为3.9%～5.8%[20]，中国内地人群为5.4%～12.5%，在日本人群中并未发现Y402H变异与AMD的关联，在中国人群中虽发现有关联，但人群归因危险度明显低于高加索人群[21]。因此CFH Y402H多态性位点虽然在AMD的病理机制中起重要的作用，但是存在种族差异。
本研究也发现ARMS2 A69S多态性位点与AMD存在关联。ARMS2/丝氨酸肽酸1(HtrA serine peptidase 1，HTRA1)与AMD的关联在日本人群中也得到了验证[22]。在中国北方人群中进行的病例对照研究也得出类似的结果，ARMS2/HTRA1与新生血管性AMD相关[23]。除了ARMS2基因的主效应，本研究还探讨了ARMS2基因与环境因素的交互作用，调整年龄、性别和饮酒因素后，发现吸烟与ARMS2 A69S的Index S为2.108，提示两者存在协同作用，国外也有部分研究发现吸烟与ARMS2存在交互作用。吸烟在目前认为可能引起黄斑变性的几种机制中都有一定的作用，它可以影响黄斑色素细胞，引起氧化损伤，破坏脉络膜微循环。目前ARMS2基因的生物学机制还不明确，其与同位于10号染色体的HTRA1基因存在连锁不平衡，有研究发现AMD病人的玻璃膜疣含有HTRA1 抗体[24]，HTRA1在脉络膜新生血管形成及AMD的发展过程中起到重要的作用，因此吸烟和ARMS2/HTRA1基因可能在脉络膜微循环改变中共同发挥作用。染色体10q26上基因位点突变与AMD发生具有确切的相关性，其功能还有待探讨。
Rothman[25]认为，生物学交互作用的评价基于相加模型更具有公共卫生学意义，建议用RERI、API、Index S三项指标来评价相加交互作用。RERI与Index S评价两因素同时作用时的联合作用与单独作用之和的差别;API则评价两因素同时存在的病例中可归因于两因素交互作用的病例所占的比例[26]。本研究发现吸烟与Y402H和A69S存在区别于相乘交互作用的相加交互作用(交互作用指数>1)，提示存在协同作用，但这仅仅是统计上的结论，是否真正存在生物学意义上的交互作用，还需进一步研究。
综上所述，CFH Y402H多态性位点与AMD相关，且吸烟能增加其效应，但该位点在中国人群中突变率低;ARMS2 A69S多态性位点与AMD相关，并且与吸烟存在交互作用，纳入更多相关位点和环境因素进行基因与环境因素的交互作用分析将有助于了解AMD的发病机制，对于个体尤其是高危个体的早期预防具有指导意义。
志谢　感谢来自北京、上海、广州、西安、青岛、武汉、长沙、温州、南京、成都、沈阳和哈尔滨的16家三甲医院眼科中心医护人员对本调查的大力支持，感谢所有研究对象的认真参与和配合
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