注射用头孢拉定无菌检查试验及方法学验证

1　材料与方法

取注射用头孢拉定20支(规格0.5g)，注入0.9%无菌氯化钠溶液适量(约5ml)，使溶解，每支取5ml转溶至0.9%无菌氯化钠溶液500ml中，备用。

将供试液按薄膜过滤法过滤，用0.1%蛋白胨溶液800ml冲洗，每次冲洗量为100ml，过滤完毕，将滤膜剪成三份，分别放入50ml硫乙醇酸盐培养基两管，其中一管作为阳性对照，加入金黄色葡萄球菌10-100cfu/ml,50ml改良马丁培养基试管一管，按规定温度培养，每天观察并记录结果。

1.1　实验环境

(见表1)表1　实验室洁净度测定结果

1.2　试验用药品：注射用头孢拉定，规格：0.5g/支，批号：1103113。哈药集团三精制药股份有限公司。

1.3　验证用菌种：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]

1.4　验证用培养基：

营养琼脂培养基 批号：100225玫瑰红钠琼脂培养基 批号：100105硫乙醇酸盐流体培养基 批号：100908营养肉汤培养基 批号：100121改良马丁培养基 批号：100110以上培养基均由中检所提供。

1.5　菌液制备：

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物少许至硫乙醇酸盐流体培养基中，33℃培养24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，27℃培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml的菌悬液。

将黑曲霉斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28℃培养5-7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

2　试验及方法

供试液的制备：取注射用头孢拉定140支(每20支为一组)，向20支样品中分别注入0.9%无菌氯化钠溶液5ml，使溶解，将溶解液全部转溶至0.9%无菌氯化钠溶液500ml中，备用。

2.1　试验组：将上述供试液按薄膜过滤法过滤，用0.1%蛋白胨溶液800ml冲洗，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml(10-100cfu/ml)各试验菌，过滤完毕，将滤膜剪成3份，其中一份放入相应培养基中，按规定温度培养，每天观察并记录。

2.2　阳性对照：另取6个试管，不过滤供试品，其它操作同上，作为各验证菌的阳性对照，按规定温度培养3～5天，观察并记录结果。

2.3　阴性对照：另取过滤器过滤稀释剂及冲洗液，除了不加供试液及菌液，其余与供试品处理方法一致，分别按规定放入相应培养基内于33℃及27℃培养。

2.4　供试品对照组：将其中一份供试液按薄膜过滤法过滤，用0.1%蛋白胨溶液800ml冲洗，每次冲洗量为100ml，过滤完毕，将滤膜放入相应培养基中，按规定温度培养，每天观察并记录。以上各组结果见表3

3　结果

表2　活菌计数表3　试验结果

4　讨论

由于某些药品制剂可能具有抑菌作用，在建立无菌检查法时，应考虑一定检验量及一定条件下药品可能有抑菌作用而发生结果误判，即必须对药品的抑菌作用及所建立的检验方法可靠性进行验证，以确定适宜本品的无菌检查法。本试验依据《中国药典》2010年版“无菌检查法”项下进行，对注射用头孢拉定的无菌检查法进行了方法学验证。经过验证，各试验菌均生长良好，所以供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，故可以照此检查法和检查条件进行注射用头孢拉定的无菌检查。

【参考文献】

[1]　国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版二部[S].中国医药科技出版社.

[2]　中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范2010年版[S].中国医药科技出版社.