大量分离乳猪肝细胞方法的实验观察

近年来，生物人工肝(BioartificialLiver，BAL)对肝衰的治疗受到广泛关注，特别是以培养肝细胞为基础的现代生物人工肝支持系统逐渐成为研究的重点。BAL的应用需要大量高活性的肝细胞，因此肝细胞的分离、保存和运输等问题成为体外生物人工肝研究和应用技术研究热点之一。近十余年来，肝的胶原酶灌流消化分离技术与方法日益成熟，均取得了较为满意的结果[1-3]。本研究基本上沿用了国内外的经典胶原酶体外两步灌流法分离乳猪肝细胞，试验中，改用了肝上下腔静脉作为灌注口进行循环灌注(结扎肝下下腔静脉)，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择5～10日龄健康小乳猪8只，体重1.7～2.1 kg，雌雄不限，由本院动物试验中心提供。Ⅳ胶原酶、Hanks液和 RPMI1640为Gibco公司产品;HGF、EGF为Sigma公司产品。将 8只购自我市专业养殖场的乳猪随机分成两组。A组为实验组，即结扎肝下下腔静脉，采用肝上下腔静脉逆行灌注的体外两步灌流法组(4只);B组为对照组，即采用门静脉灌注的体外两步灌流法组(4只)。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法：每次试验前随机决定行何种方式。试验猪使用前由本动物试验中心清洁饲养1周，术前禁食12 h，禁水4 h。氯安酮(30 mg/kg)肌内注射麻醉，常规消毒皮肤，开腹。分离肝门、周围韧带以及肝上、下腔静脉，门静脉内注入150 IU的肝素钠，游离肝脏后完整切除。A组：结扎肝下下腔静脉，肝上下腔静脉插管，以肝上下腔静脉为灌流入口，门静脉与肝动脉为灌流出口，先用无Ca2+、Mg2+的Hanks液灌流，共500 ml，其中前 300 ml灌流后丢弃，后200 ml循环使用，流速60～80ml/min，时间约10～15 min，至肝脏变白;再用含Ca2+、Mg2+的Hanks液 200 ml循环灌流3～5 min;最后用浓度为0.05%的胶原酶灌流液 250 ml循环灌流，流速约40～60ml/min，时间约为10～15 min，至肝脏呈土黄色，肝组织崩解为止。B组：门静脉插管，以门静脉为灌流入口，先用无Ca2+、Mg2+的Hanks液灌流，共 500ml，其中前300 ml灌流后丢弃，后200 ml循环使用，流速 60～80 ml/min，时间约10～15 min，至肝脏变白;再用浓度为0.05%的胶原酶灌流液250 ml循环灌流，流速约40～60 ml/min，时间约为10～15min，至肝脏呈土黄色，肝组织崩解为止。A 组、B组均于灌流结束后，剪刀划破肝包膜，剔除纤维结缔组织，收集肝细胞，将肝细胞悬液酌情再置37℃条件下振荡消化10～15 min。RPMI1640培养液终止消化，200目尼龙网过滤 2次，1 000 r/min反复离心3次获取肝细胞悬液。

1.3 观察指标：①在倒置相差显微镜下，使用血细胞计数板计数并计算每克肝肝细胞数。②台盼蓝拒染试验判断细胞活力。③ 自动生化仪分析上清液中AST、ALT、LDH以及TBIL浓度。

1.4 统计学方法：使用SPSS18.0对各项资料进行统计、分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同方法提取肝细胞的每克肝肝细胞数和细胞活力值，不同方法提取肝细胞上清液中AST、ALT、LDH以及TBIL浓度值。

3 讨论

BAL(Bioartificial Liver)中起核心作用的是肝细胞，其肝细胞的来源选择和分离、培养方式以及生物反应器工作模式是构建现代生物人工肝的关键。动物肝细胞尤其是猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近，因而成为目前临床应用最为广泛的生物人工肝肝细胞来源[4]。乳猪肝细胞消化分离的经典方法是两部灌流、胶原酶消化法，目前各个报道的猪肝细胞产量及活力差别较大，即使采用相同的消化方法和过程，有时也可以得到出入较大的结果[5-6]。 Wang等对猪肝细胞消化分离的21项参数进行了单因素和多因素回顾性分析，主要影响因素有猪重量、猪肝重量、灌流液消化时间、灌流液pH值、钠和氯化物浓度范围以及胶原酶等，提示猪肝细胞的分离过程需要严格质量控制[7]。研究基本沿用经典的胶原酶体外两步灌流法分离乳猪肝细胞，试验中，采用了肝上下腔静脉进行逆行灌注(结扎肝下下腔静脉)。从理论上说，相对于采用门静脉灌注，采用肝上下腔静脉逆行灌注可以使肝内门静脉和肝动脉两个系统均得到充分灌注，灌注更充分，能更好的发挥胶原酶效力，从而减少胶原酶的用量和灌注时间，减轻了在肝细胞提取过程中不可避免的额外肝细胞损伤;同时肝内动、静脉两个系统的血液成分也充分被冲洗掉，增加了提取肝细胞纯度。试验中也观察到这一点，但需要进一步大量的实验研究才能证实。

4 参考文献

[1] 李 择,孙家邦.从手术切除肝组织和屠宰房肝组织分离肝细胞 [J].中华肝胆外科杂志,1999,5(2):268.

[2] Nelson LJ,Newsome PN,Howie AF,et al.An improvedex vivo method of primary porcine hepatocyte isolation for use in bioartificialliver systems[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2000,12(6):923.

[3] 王英杰,刘国栋,刘 俊,等.大量分离乳猪肝细胞的方法[J].世界华人消化杂志,1999,20(7):661.

[4] Donato MT,Castell JV,Lechon MJ.Characterizationof drug metabolizing activities in pig hepatocytes for use in bioartificialliver devices:comparison with other hepatic cellular models[J].JHepatol,1999,31(3):542.

[5] Seglen PO.Preparation of isolated rat livercells[J].Methed Cell Biol,1976,13(1):29.

[6] Seglen PO.Preparation ofhepatocytes by collagenase perfusion[J]. Methed Toxicol,1993,21(2):231.

[7]Wang L,Sun J,Wang C,et al.Analysis of multivariables during porcine liverdigestion to improve hepatocyte yield and viability for use in baioartificalliver support systems[J].Cell Transplant,2000,9(2):329.

[收稿日期：2013-12-28 编校：徐强]